男性不育症是夫妻不孕不育的重要因素之一。国内有研究显示，约有15%的育龄期夫妇患有不育症或曾面临不育问题，其中男方因素约占50%[1]。目前，精液常规分析作为临床上最常用的评估男性生育能力的指标，在需筛选优质精子的辅助生殖技术等领域存在一定的局限性，已不能满足临床要求[2-3]。作为传统常规精液检查的重要补充，精子DNA碎片率(DNA fragmentation index，DFI)检测为判断精子质量的优劣提供了一个新的参考方法[4]。随着对精子DNA损伤研究的深入，研究者们发现精子DFI能更好地评估男性生育力，同时在预测辅助生殖技术助孕结局上具有尤为重要的作用[5]。因此，检测精子DFI对不育患者精子质量的评估具有极大的价值。本文旨在分析精子 DNA碎片率与患者年龄、精液常规参数的相关性，研究精子DNA损伤在评估男性生育能力中的应用价值。
资料与方法
1.一般资料：选择2015年6月—2018年12月在武汉大学中南医院生殖医学中心就诊的2 963名男性作为研究对象。纳入标准包括(1)武汉市常驻人口；(2)年龄18岁及以上；(3)精子浓度≥5×106 /ml；(4)取精过程无遗漏；(5)男性生殖系统体格检查(包括第二性征、阴茎、阴囊、精索、输精管、附睾、睾丸等)均无异常者等。
2.标本收集：患者禁欲2～7 d，手淫法收集新鲜精液于洁净广口取精杯内，立即放置于35℃温箱中液化后将标本分成两份，一份行常规精液分析，一份行精子DFI检测。
3.精子DNA碎片率检测：采用精子染色质扩散法(sperm chromatin dispersion,SCD)检测精子DFI，使用安徽安科生物科技有限公司的精子DNA碎片染色试剂盒(产品备案号：皖合械备20160005)。严格按照说明书进行操作，在普通光学显微镜下观察计数200条以上精子，计数存在DNA碎片的精子的数量。判断标准为精子头部仅产生较小的光晕或无光晕，或单侧光晕的厚度不超过精子头部最小直径的1/3，均被判断为存在DNA碎片的精子。精子DFI=存在DNA碎片的精子个数/计数总精子个数×100%。
4.精液分析：根据《世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册》第五版标准[6]，通过应用计算机辅助精液分析系统(CASA)分析精子常规参数。将10 μl已经完全液化的精液加至以色列产精子计数板(Makler counting chamber，sefi-medical instruments)配合CASA进行分析，得到精子浓度、总活力、前向运动精子百分率等并记录。
5.统计学处理：应用SPSS16.0统计软件进行分析。计量资料采用均数±标准差表示；变量间的相关性分析采用Pearson相关分析，以P<0.01为差异有统计学意义。多因素间的相关性分析采用多元线性回归分析，以R2>0.25为大效应，显著性值P<0.001表明有极显著的统计学意义。
结果
1.精子DFI与患者年龄、精液常规参数一般情况：2 963例患者的年龄、精液常规参数及精子DFI均符合正态分布。患者年龄平均为(33.9±6.3)岁，禁欲时间为(3.9±1.3)d，精液液化时间为(28.0±8.3)min，精液量为(3.4±1.5)ml，精子浓度为(62.2±43.7)×106/ml，精子总数为(198.9±156.4)×106精子/每次射精，精子总活力为(47.2±17.5)%，精子正常形态率为(6.1±2.4)%，精子DFI为(12.5±7.5)%。
2.精子DFI与患者年龄、精液常规参数的相关分析结果：Pearson相关分析结果显示，精子DFI与患者年龄(r=0.254,P<0.01)、禁欲时间(r=0.181,P<0.01)、液化时间(r=0.094,P<0.01)、精液量(r=0.062,P<0.01)、精子总数(r=0.056,P<0.01)均呈正相关，精子DFI与精子总活力呈负相关(r=-0.505，P<0.01)，精子DFI与精子正常形态率呈负相关(r=-0.212，P<0.01)；精子浓度与精子DFI不存在相关性(P>0.01)。
3.多元线性回归分析结果：构建模型后得到R2=0.325、调整R2=0.324、Durbin-Watson=1.856，R2>0.25表明为大效应，模型拟合优度较高，同时DW值接近2，认定残差独立通过检验。进一步采用F检验方法对回归方程进行显著性检验,得到结果F=356.272，P<0.001，表明回归方程有极显著的统计学意义。表1数据显示，患者年龄、精子总数、活力、正常形态率与精子DFI之间的线性伴随变化有极显著的统计学意义(t年龄=10.377，P<0.001，t精子总数=12.839，P<0.001，t精子总活力=-30.480，P<0.001，t精子正常形态率=-4.087，P<0.001)。回归方程为精子DFI=15.827+0.189×年龄+0.01×精子总数-0.22×精子总活力-0.208×精子正常形态率，说明当患者年龄增长1岁，精子DFI值会增长0.189%；当精子总数增长1×106，精子DFI值会增长0.010%；当精子总活力增长1%，精子DFI值会降低0.220%；当精子正常形态率增长1%，精子DFI值会降低0.208%。回归分析显示标准化残差左右两侧对称，P-P图中散点均靠近斜线，回归残差满足正态性。
讨论
人类精子DNA损伤是一种常见的男性生殖能力下降的原因[7]。在各种内外环境及遗传因素的影响下，如年龄、生活作息、吸烟、环境污染、某些疾病感染等，均会导致精子DNA不同程度的损伤[8]。目前认为，导致精子DNA损伤主要有3个原因，即精子染色质组装异常，精子细胞的异常凋亡及氧化应激反应[9-10]。而染色质组装异常是其损伤的主要原因[7]。为确保DNA双链结构的稳定，精子在成熟过程中大量巯基被氧化成二硫键，使得DNA结合更紧密，但当其被多种有害的因素影响时，发育异常的精子中巯基未被氧化成二硫键，DNA由双链断裂，或变形为单链，这样就形成精子DNA碎片 [11]。常用于检测精子 DNA 完整性的方法有精子染色质结构分析(sperm chromatin structure assay，SCSA)、彗星实验(comet assay)、末端转移酶介导的dUTP末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)和SCD法[12]等。相较而言，SCD法具有操作简便、快捷、准确、经济、重复性较好等优点[13]，自2003年Fernandez等[14]发明以来已被广泛应用于精子 DNA 完整性的研究。本研究采用SCD法检测精子DNA完整性，结果可靠。
表1 精液常规参数在方程中的回归系数结果
参数非标准化系数BS标准系数tP共线性统计量容差VIF常量15.8270.76620.6750.000年龄0.1890.0180.15910.3770.0000.9661.035精子总数0.0100.0010.20312.8390.0000.9121.096精子总活力-0.2200.007-0.511-30.4800.0000.8101.235正常形态率-0.2080.051-0.066-4.0870.0000.8681.152
学者们对男性不育患者的年龄与其精子DFI相关性的研究比较多。本研究显示，随着男性年龄的增加，精液中精子DFI显著升高，与大多数学者的研究结果一致[15-17]。究其原因，现有的研究数据表明，随着男性年龄增长，睾丸、前列腺和附睾等器官逐渐老化，导致活性氧自由基( reactive oxygen species，ROS) 增多及其抗氧化能力下降[18]。ROS生成量超过了精子抗氧化的防御能力的极限，那么就会导致机体内活性氧积聚，诱导氧化应激损伤精子质膜完整性和流动性，最终损伤精子核 DNA[19]。男性随着年龄增加而引起的精子DNA损伤，将会影响胚胎发育，除导致不良的辅助生殖结局外，还增加胎儿出生缺陷发生及子代异常的风险[20-21]。可见，加强精子DNA完整性的检测，对于评价男性不育具有重要的作用。
精子活力和精子正常形态率作为精液常规分析中的两个重要参数，也反映着男性的生育力。本研究中，精子DFI与精子活力、精子正常形态率呈负相关，与新疆[22]、深圳[23]、上海[24]、沈阳[25]等多地区对男性不育患者的年龄、精液参数与其精子DFI相关性的研究结论一致。精子线粒体作为调节精子运动的主要细胞器，提供精子运动所需主要能量来源，在精子DNA损伤后该细胞器产生的能量异常会导致精子活动能力的下降[26]，而引起男子不育。还有学者认为，过多的精子DNA链断裂，可诱导精子细胞凋亡，反映在精子形态结构、精子活动率以及前向运动精子等活动状态 [27]。本研究结果中，精子DFI与精液量、精子总数呈正相关，但精子浓度与精子DFI关系分析无统计学意义。在很多学者的研究结果中，精液量和精子浓度与DFI的关系是有争议的，但对精子总数与DFI的关系研究不多。自然受孕或辅助生殖助孕过程中，除精子活力外，一次射精的总数仍起重要作用。临床检验过程中，因检测方式的局限性，对于精子浓度极低的标本，无法进行精子DFI的检测。因此，不排除是因样本选择的局限性导致精子浓度与DFI的阴性结果。另外，本研究结果显示，禁欲时间、液化时间等与精子DFI均呈正相关，与此前研究结果一致[28]。考虑因精液中精子细胞是ROS的主要内源性来源[29]，随着禁欲时间延长，精液量相对增多，累积的精子总数亦增多，引起内源性ROS增高，从而导致DFI增高。
本研究分析了精子DFI与年龄、精液常规等两两之间的关系，为了更直观的了解到各参数对DFI影响更直观的结果，将相关性较高且学者们关注的较多的男性年龄、精子总数、活力、正常形态率等因素进一步进行多因素分析，得到了具有极显著统计学意义的结果，并可以根据回归方程在一定程度上预测其对应精子DFI情况。
综上所述，精子DNA完整性与年龄及精子总数、活力、正常形态率等均相关，年龄是导致DFI升高的关键因素，DFI升高亦可导致精子活力与正常形态率等下降。精子DFI结合精液常规检查能更好地评估男性生育力，为进一步的研究精子DFI与男性不育等更深入的机制研究提供了理论基础。本次研究尚存在不足，如未纳入精子浓度<5×106/ml的标本，未依据年龄和精子DFI进行更细化的分组。今后有必要扩大检测地域，加大样本量，并进行更细化的分组等深入研究。
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