子宫内膜癌(endometrial cancer，EC)是女性常见生殖道恶性肿瘤，临床调查表明[1]，在中国女性生殖系统恶性肿瘤患者中，EC占比约为20%～30%，且随着女性生活压力的增加，发病率逐年升高，成为威胁女性健康的重要疾病之一。EC多为腺癌，腺癌对放疗敏感性差，故其治疗多以手术为主[2]，故探讨EC细胞的增殖和凋亡机制，寻找有效治疗药物和治疗靶点，对疾病的转归及预后均有重要意义。研究发现[3-4]，紫草素除具有抗菌、抗炎等多种潜在药用价值外，其抗肿瘤作用已成为研究热点。目前，关于紫草素对部分EC细胞的影响已有报道，但具体调控机制尚不明确。为此，本研究通过观察紫草素对人EC细胞株RL95-2磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路的影响，探讨其对EC可能治疗作用。
材料与方法
1.材料：(1)细胞。购于上海生科院细胞库人EC细胞株RL95-2。(2)药物、主要试剂和仪器。紫草素(中国药品生物制品鉴定所，纯度>98%)，异硫氰酸荧光素标记的连接素(Annexin-FITC)细胞凋亡检测试剂盒(广州碧云天有限公司)，RPMI-1640培养基、胎牛血清(Gibco公司)，逆转录试剂盒(Takara公司)，BCA蛋白定量分析试剂盒(Thermo公司)，兔抗大鼠磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)单抗、蛋白激酶B(Akt)单抗、磷酸化Akt(p-Akt)多抗、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)单抗(一抗)、山羊抗兔PI3K、Akt、p-Akt、mTOR(二抗，Abcam公司)。DMi8型倒置显微镜(徕卡公司)，Cyto FLEX型流式细胞仪(Beckman Coulter公司)，SAF-680T酶标仪(上海巴玖实业有限公司)，ABI ViiA TM7实时荧光定量PCR仪(ABI公司)，电泳仪、CheniDoc XRS化学发光成像系统(Bio-rad公司)。
2.细胞培养、干预及形态学观察：人EC细胞株RL95-2接种于RPMI-1640培养液(含10%胎牛血清)中，放置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度温箱中培养，隔天换液，3～5 d后胰蛋白酶消化，调整细胞密度进行传代培养。取对数期生长细胞，胰蛋白酶消化以1×105个/ml接种于96孔板，待细胞再次贴壁生长后，加入不同浓度紫草素，使各孔紫草素中浓度分别为0 μg/ml、0.4 μg/ml、0.8 μg/ml、1.2 μg/ml，每孔设置5个复孔，分别设为对照组、研究1组、研究2组、研究3组，原培养条件下继续培养48 h后，于倒置显微镜下观察细胞形态学变化。
3. 四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(methylthiazolyltetrazolium，MTT)法检测各组细胞增殖情况：调整细胞密度以1×104个/ml接种于96孔板，细胞70%左右贴壁生长时，随机分为4组，每组各取5个复孔，以紫草素终浓度0 μg/ml、0.4 μg/ml、0.8 μg/ml、1.2 μg/ml进行干预，培养至24 h、48 h、72 h时，加入5 mg/ml的新鲜制备的MTT溶液20 μl，同条件培养4 h后弃去上层培养液，各孔加入DMSO溶液150 μl，充分震荡10 min使溶液澄清无结晶，测定570 nm处吸光光度(A)值，所有实验重复3次。
4.检测细胞凋亡率：胰蛋白酶消化并收集干预48 h的RL95-2细胞，PBS洗涤细胞3次并进行重悬，3 000 rpm离心8 min，以预冷70%乙醇溶液进行固定，4℃过夜后加入浓度为100 μg/ml RNA酶，置于37℃孵育30 min，5 μl Annexin V-FITC、5 μl碘化丙啶，充分混匀，避光孵育10 min(室温)，过滤后在1 h内采用流式细胞仪分析细胞凋亡率。
5.检测PI3K、AKT、mTOR mRNA表达：收集干预48 h的细胞，Trizol法提取总RNA，用逆转录试剂盒获得逆转录互补脱氧核糖核酸(cDNA)，琼脂糖凝胶电泳鉴定，实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)，严格按照试剂盒设定反应体系，反应条件为(1)94 ℃预变性2 min；(2)94 ℃变性20 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，重复38个循环，72 ℃延伸5 min。以β-actin作为内参对照物，所有实验重复3次取平均值，2-△△CT为目的基因的相对表达强度，计算PI3K、AKT、mTOR相对表达量。引物序列见表1。
6.检测PI3K、AKT、pAKT、mTOR蛋白表达：收集干预48 h的细胞，按照蛋白提取试剂盒说明书进行蛋白定量。取20 μg待测样品与上样缓冲液混匀后，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，电转仪转膜1.5 h，封闭液摇床封闭2 h，洗涤后加入一抗(1∶10 00)，4℃摇床孵育过夜，洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶10 000)，常温孵育2 h，暗室中曝光，然后扫描拍照，采用BandScan工具进行灰度值分析，以PI3K、AKT、pAKT、mTOR蛋白灰度值与内参β-actin灰度值比值描述蛋白表达情况。
表1 引物序列
基因 引物序列PI3K 上游引物5′-ATCGATCGATCGTAGCTAGCTCGA-3 下游引物5′-CGTACGTAGCTAGCTAGCTAGCTG-3′AKT 上游引物5′-GTAGCTACTAGCTATCAGTCATCGT-3′ 下游引物5′-CGTAGCTAGCTAGCTAGCTGATCGC-3′mTOR 上游引物5′-AGTCGATCGTACGTAGCTGATGCT-3′ 下游引物5′-CGTACTACGTACGATCGTGTACGA-3′β-actin 上游引物5′-CGTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTC-3′ 下游引物5′-ACTAGCTAGCTAGTCGATCGTACG-3′
7.观察指标：(1)细胞形态学观察；(2)MTT实验A值对比；(3)细胞凋亡率对比；(4)PI3K、AKT、mTOR mRNA相对表达量对比；(5)PI3K、mTOR蛋白表达情况、pAKT/AKT对比。
8.统计学处理：采用SPSS20.0统计软件分析处理数据，计量资料均以
描述，多样本计量资料比较采用单因素方差分析，两两样本比较采用SNK-q检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
结果
1.细胞形态学观察：倒置显微镜下观察对照组细胞生长状态良好，3个研究组细胞数量减少、轮廓及遮光性增强，部分细胞胞浆可见空泡，细胞收缩变圆、部分漂浮状态，其中研究3组生长状态最差。见图1。
2.MTT实验A值对比：不同时刻MTT实验A值组间比较，差异均有统计学意义；3个研究组不同时刻MTT实验A值均低于对照组，与对照组比较，差异均有统计学意义；研究3组低于研究1组和研究2组，研究2组低于研究1组，差异均有统计学意义；各组MTT实验A值随时间的延长呈显著增加趋势(P<0.05)。见表2。
表2 MTT实验A值对比
组别样本数24 h48 h72 h对照组50.315±0.0340.581±0.063d0.872±0.089de研究1组50.264±0.031a0.462±0.050ad0.661±0.070ade研究2组50.220±0.028ab0.377±0.043abd0.532±0.055abde研究3组50.183±0.020abc0.285±0.031abcd0.376±0.042abcde
注：与对照组比较，aP<0.05；与研究1组比较，bP<0.05；与研究2组比较，cP<0.05；与24 h比较，dP<0.05；与48 h比较，eP<0.05
3.细胞凋亡率对比：细胞凋亡率组间比较，差异均有统计学意义；3个研究组细胞凋亡率均高于对照组，差异均有统计学意义；研究3组高于研究1组和研究2组，研究2组高于研究1组，差异均有统计学意义。见表3、图2。
表3 细胞凋亡率对比
组别样本数凋亡率(%)对照组55.12±0.69研究1组58.60±1.06a研究2组515.14±2.34ab研究3组529.57±3.24abc
注：与对照组比较，aP<0.05；与研究1组比较，bP<0.05；与研究2组比较，cP<0.05
(A：对照组；B：研究1组；C：研究2组；D：研究3组)
图2 流式细胞术检测各组细胞凋亡率
4. PI3K、AKT、mTOR mRNA相对表达量对比：PI3K、AKT、mTOR mRNA相对表达量组间比较，差异均有统计学意义；3个研究组PI3K、mTOR mRNA相对表达量均低于对照组，差异均有统计学意义；研究3组低于研究1组和研究2组，研究2组低于研究1组，差异均有统计学意义；AKT mRNA相对表达量组间比较，差异无统计学意义。见表4。
5. PI3K、mTOR蛋白表达情况、pAKT/AKT对比：PI3K、AKT、mTOR蛋白相对表达量、蛋白表达比值AKT/pAKT组间比较，差异均有统计学意义；3个研究组PI3K、mTOR蛋白相对表达量、蛋白表达比值AKT/pAKT均低于对照组，差异均有统计学意义；研究3组低于研究1组和研究2组，研究2组低于研究1组，差异均有统计学意义。见表5、图3。
表4 PI3K、AKT、mTOR mRNA相对表达量对比
组别样本数PI3KAktmTOR对照组50.95±0.100.82±0.090.75±0.08研究1组50.68±0.08a0.81±0.08a0.56±0.07a研究2组50.50±0.07ab0.83±0.10ab0.42±0.05ab研究3组50.37±0.05abc0.82±0.09abc0.21±0.03abc
注：与对照组比较，aP<0.05；与研究1组比较，bP<0.05；与研究2组比较，cP<0.05
表5 PI3K、mTOR蛋白表达情况、AKT/pAKT对比
组别nPI3KpAKT/AKTmTOR对照组50.91±0.120.82±0.091.10±0.12研究1组50.67±0.08a0.74±0.08a0.89±0.09a研究2组50.42±0.05ab0.51±0.06ab0.54±0.06ab研究3组50.25±0.03abc0.10±0.02abc0.15±0.03abc
注：与对照组比较，aP<0.05；与研究1组比较，bP<0.05；与研究2组比较，cP<0.05
图3 蛋白免疫印迹图
讨论
EC发病原因多种多样，体重、妊娠史、月经史、家族史等多种因素均与其发病相关[5]。EC主要由两大类组成，一种为临床中常见的EC腺癌，其发生机制与雌激素长期过度刺激有关，分化程度高；另一种较为少见，属于特殊亚型癌，分化程度低，预后差[6]。早期EC发现并给予有效治疗对生存率的延长十分重要，但晚期预后差，整体生存率低。目前，临床中EC仍以手术切除结合化疗、激素治疗等综合治疗为主。常用化疗药物主要通过细胞毒性作用诱导癌细胞凋亡，但其靶向性差，易产生较为明显的副作用[7-8]。紫草是中医学妇科常用药材，其有效成分紫草素是一种萘醌类化合物。现代药理学研究表明[9]，紫草素具有抗菌、抗雌激素、免疫调节等多种作用，其对癌细胞的增殖抑制和凋亡促进作用日益受到关注。
本研究倒置显微镜下观察，3个研究组细胞数量减少、生长状态较差，其中研究3组生长状态最差；3个研究组MTT实验A值均低于对照组(P<0.05)，研究3组低于研究1组和研究2组(P<0.05)，研究2组低于研究1组(P<0.05)，细胞凋亡率与上述结果相反，提示紫草素抑制EC细胞株RL95-2的增殖，并且促进其凋亡，其中1.2 μg/ml的紫草素效果最佳。紫草出自《神农本草经》，其根可入药，具有清热凉血、活血解毒之功[10]。紫草素是从紫草中提取的有效成分，现代药理学研究证实，紫草素对多种肿瘤细胞，如胰腺癌细胞、结肠癌等均具有增殖抑制和凋亡促进作用，且具有剂量及时间依赖性[11-12]。本研究通过倒置显微镜观察发现，不同浓度紫草素干预48 h后，EC细胞株RL95-2的生长受到抑制，且呈现细胞数目减少、细胞收缩、漂浮等不良生长状态，且经MTT实验证实其增殖速度降低，以1.2 μg/ml的增殖抑制效果最佳。舒海燕等研究发现[13]，不同浓度紫草素对宫颈癌细胞株Caski具有凋亡促进作用，且具有剂量和时间依赖性，与本研究结果相似。本研究通过MTT实验发现，不同剂量紫草素干预后，RL95-2细胞凋亡率增加，可能与紫草素通过影响凋亡相关基因的表达，从而激活细胞程序性凋亡信号，发挥凋亡促进作用有关。因此，紫草素对人EC细胞株RL95-2具有增殖抑制和凋亡促进作用。
PI3K/Akt/mTOR信号通路已证实在乳腺癌、卵巢癌、肺癌及子宫内膜癌等多种人类恶性肿瘤处于激活状态[14]，参与肿瘤细胞新陈代谢、增殖、凋亡等多种生物学过程，对肿瘤相关发展进程有重要意义。本研究中，3个研究组PI3K、mTOR mRNA和蛋白相对表达量、蛋白表达比值Akt/pAkt均低于对照组(P<0.05)，研究3组低于研究1组和研究2组(P<0.05)，研究2组低于研究1组(P<0.05)，提示紫草素可通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制EC细胞株RL95-2的增殖，促进其凋亡。肿瘤细胞的增殖和凋亡均受细胞内多条基因调控，细胞外界因素可通过信号转导系统进而影响相关基因的表达，从而间接调控作用[15]。PI3K是一种异源二聚体，Akt是PI3K下游效应分子，当胞外刺激信号激活细胞表面PI3K后，Akt发生膜转为进而磷酸化激活，p-Akt进入胞内，进而活化下游靶基因而发挥凋亡促进作用[16]。mTOR是细胞分裂及合成代谢的调控中心，增殖相关因子的信号、营养状态的信息可通过Ⅰ型PI3K及下游Akt传递给mTOR启动靶点TOR复合体1(TORC1)，达到活化阈值后可激活mTOR，将细胞分裂阻滞于G0/G1期，抑制癌细胞增殖[17-18]。综合上述分析，紫草素可通过调控PI3K/Akt/mTOR信号通路相关基因和蛋白的表达，启动了RL95-2细胞增殖抑制和凋亡通路，发挥抗肿瘤作用。
综上所述，紫草素可通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制EC细胞株RL95-2的增殖，并且促进其凋亡，其中1.2 μg/ml的紫草素干预效果最佳，提示该通路作为紫草素增殖抑制和凋亡促进作用的主要靶点，可为紫草素相关药物的研发及应用于EC的治疗提供理论支持，但其是否存在其他调控机制仍需进一步探讨。
(图1见封三)
1 赵宏喜,李艳红,谢丽,等.子宫内膜癌的流行病学特点及其转移的危险因素分析.现代肿瘤医学,2017,25:3803-3805.
2 Rossi L,Le Frere-Belda MA,Laurent-Puig P,et al.Clinicopathologic Characteristics of Endometrial Cancer in Lynch Syndrome:A French Multicenter Study.Int J Gynecol Cancer,2017,27:953-960.
3 Bi Y,Zhu Y,Zhang M,et al.Effect of Shikonin on Spinal Cord Injury in Rats Via Regulation of HMGB1/TLR4/NF-kB Signaling Pathway.Cell Physiol Biochem,2017,43:481-491.
4 Lin HY,Han HW,Sun WX,et al.Design and characterization of α-lipoic acyl shikonin ester twin drugs as tubulin and PDK1 dual inhibitors.Eur J Med Chem,2018,144:137-150.
5 曾靖,李艳,金滢,等.子宫内膜癌淋巴结转移的危险因素及预后分析.基础医学与临床,2017,37:454-462.
6 Grevenkamp F,Kommoss F,Kommoss F,et al.Second Opinion Expert Pathology in Endometrial Cancer:Potential Clinical Implications.Int J Gynecol Cancer,2017,27:289-296.
7 Winship A,Van Sinderen M,Rainczuk K,et al.Therapeutically blocking Interleukin-11 Receptor-α enhances doxorubicin cytotoxicity in high grade type I endometrioid tumours.Oncotarget,2017,8:22716-22729.
8 Tülüce Y,Lak PTA,Koyuncu 
al.The apoptotic,cytotoxic and genotoxic effect of novel binuclear boron-fluoride complex on endometrial cancer.Biometals,2017,30:933-944.
9 黄贵莲,周月广,金鑫,等.紫草素体外抗菌活性的实验研究.三峡大学学报:自然科学版,2017,39:8-10.
10 张历元,李元文,张丰川,等.紫草的古今炮制与应用.世界中医药,2017,12:2186-2189.
11 Chen C,Xiao W,Huang L,et al.Shikonin induces apoptosis and necroptosis in pancreatic cancer via regulating the expression of RIP1/RIP3 and synergizes the activity of gemcitabine.Am J Transl Res,2017,9:5507-5517.
12 Liang W,Cui J,Zhang K,et al.Shikonin induces ROS-based mitochondria-mediated apoptosis in colon cancer.Oncotarget,2017,8:109094-109106.
13 舒海燕,柯丽娜,陈富超,等.紫草素对宫颈癌细胞株Caski增殖、凋亡及HPV E6-E7 mRNA表达的影响.山东医药,2018,58:6-8.
14 徐立群,张荣华,邹莹,等.参慈胶囊联合顺铂通过PI3K/AKT/mTOR信号通路逆转人肺腺癌顺铂耐药的机制研究.中国病理生理杂志,2017,33:500-504.
15 Li B,Yuan Z,Jiang J,et al.Anti-tumor activity of Shikonin against afatinib resistant non-small cell lung cancer via negative regulation of PI3K/Akt signaling pathway.Biosci Rep,2018,38:792-780.
16 Zeng L,Liao Q,Zou Z,et al.Long Non-Coding RNA XLOC_006753 Promotes the Development of Multidrug Resistance in Gastric Cancer Cells Through the PI3K/AKT/mTOR Signaling Pathway.Cell Physiol Biochem,2018,51:1221-1236.
17 Ni F,Huang X,Chen Z,et al.Shikonin exerts antitumor activity in Burkitt′s lymphoma by inhibiting C-MYC and PI3K/AKT/mTOR pathway and acts synergistically with doxorubicin.Sci Rep,2018,8:3317-3322.
18 周伦欢,朱雄鹏,肖慧芳,等.mTOR抑制剂雷帕霉素对伯基特淋巴瘤细胞增殖抑制的研究.中国实验血液学杂志,2017,25:1397-1405.