苯丙酮尿症(PKU)是一种先天性代谢病，其特征是苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因突变，苯丙氨酸羟化酶活性的丧失导致血液苯丙氨酸浓度过高，这将对大脑造成不可逆转的损伤。未经治疗的PKU患儿通常伴随进行性智力障碍和其他严重症状，包括湿疹、皮疹、自闭症、癫痫发作和运动障碍等。随着患儿的成长，可以观察到发育迟缓、行为异常及精神症状等。血液中苯丙氨酸(Phe)浓度升高是导致患儿精神缺陷的根本原因； Guthrie引入了一种基于大规模筛查检测PKU的方法，称为Guthrie检测[1]。目前，世界上许多地区都采用Guthrie检测或其他生化方法(如荧光检测法或酶比色法)来进行新生儿血液中Phe浓度检测，用于PKU的诊断和鉴别诊断。这些方法具有操作简便、成本低廉的优势。但酶法的准确性、精密度、灵敏度较低，荧光法检测快速、微量，其灵敏度和精确度明显高于酶法，但检测单个样本时比较费时。
高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)是一种检测与代谢疾病相关的多种生物标志物的新方法。HPLC-MS/MS技术具有灵敏度高、特异性好、易自动化、耗时短、试剂费用低、可以获取更多的定性信息等优点,大大提高了定量分析的准确性,是临床及科研工作中测定氨基酸的一种有效方法。与目前应用较多的酶法、荧光法相比较，该方法最大优点在于能够在短时间内 (2 min) 对一个样品中的几十种物质进行定性和定量，达到“一种实验检测多种疾病”的目的。另外,由于HPLC-MS/MS技术是根据物质的分子量进行定性，根据离子强度进行定量 ,从而具有较高的灵敏度和特异度。
本研究通过HPLC-MS/MS技术检测血滤纸片中Phe和Tyr浓度及其比值，同时采用时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)法作为对照，对内蒙古地区新生儿PKU进行筛查，为内蒙古地区PKU的诊断、治疗和预防提供一定的参考依据。
对象与方法
1.研究对象：2015年10月—2017年8月在内蒙古地区妇幼保健院分娩，并采集了血标本的新生儿12 910例为研究对象，其中12例因样本污染、2例因临床信息有误被排除，最终共有12 896例新生儿纳入本研究。
2.标本采集：在新生儿出生72 h内，收集足底外周血，在Whatman 903滤纸(Maidstone，UK)上点样，然后在室温下避光风干，并将滤纸干血片样本密封于真空塑料袋，保存于4℃冰箱。对于体重低于2 500克的新生儿，样品采集将推迟，直至体重达到2 500克后再采样。所有新生儿父母在收集样本前均已提交书面知情同意书。
3.检测流程：样本分别采用HPLC-MS/MS和TRFIA两种方法进行PKU筛查。将筛查结果为高风险的患儿召回进行二次复查，若结果依旧为高风险，则采用Sanger测序进一步对PKU相关基因PAH和PAH辅酶BH4的全部外显子区域及内含子/外显子交接区进行检测，若发现同源变体，则该患儿被确认为阳性病例。此外，还将检测高风险患儿父母的基因，以确定患儿的变异来源。
4.HPLC-MS/MS检测：将直径为3.2 mm的干血斑置于 96孔过滤板中，每孔加入含有氨基酸和酰基肉碱同位素内标的100 μL抽提缓冲液 。在45 ℃下以750 rpm振荡密封孵育45分钟后，将75 μl提取物转移至API3200MD(Applied Biosytems，USA)用于进一步分析。在前体离子扫描模式下扫描内标酰基肉碱，在27 eV碰撞能量下质荷比(m/z)为85，并且在中性丢失谱扫描模式下用m/z 102(12eV)扫描氨基酸。利用软件NeoBase(Perkin Elmer)和GCMS Solution(Shimadzu)分析并予以整理分析。测试结果phe浓度>120 nmol/l(即2 mg/dl)，phe/tyr浓度比>1.5即为高风险。
5.TRFIA检测：使用新生儿苯丙氨酸试剂盒(PerkinElmer，Finland)分析新生儿的血液Phe浓度。在每个直径为3.2 mm的干血斑中打孔取样后，置于含15 μl提取缓冲液的96孔酶标板中。将板在室温下孵育60 min，加入40 μl超纯水并混合，之后将25 μl混合物转移至含有50 μl茚三酮的96孔滴定板中。在60 ℃温育60分钟，加入200 μl铜试剂，将平板在60℃下恒温90分钟，最后转移至Multilabel Counter(1420 VICTOR2D，PerkinElmer)进行Phe浓度测试。定量时，该批次包含1个空白品、6个标准品(0.4 mg/dl、1.6 mg/dl、2.8 mg/dl、5.2 mg/dl和15.0 mg/dl)和2个质量对照(1.3 mg/dl和5.2 mg / dl)。测试结果Phe浓度>2 mg/dl即为高风险。
6.Sanger测序：两种方法筛选出的高风险病例进行PAH及辅酶BH4的Sanger测序，结合血液Phe浓度最终确诊PKU病例。对PAH基因的13个外显子及其内含子交接区域的10 bp内含子进行PCR扩增并测序。
7.追踪回访：对于筛查结果为阳性，测序结果为阴性的患儿每月监测Phe浓度是否低于2 mg/dl，持续半年以上，并且每半年一次电话追踪回访，询问患儿生长发育、精神表现、皮肤毛发表现等是否正常，确保没有遗漏的阳性病例。
8.伦理审查：该研究由内蒙古妇幼保健院医学伦理委员会批准并监督。
结果
1. TRFIA筛查结果：31例患者被筛选为高风险患者，phe平均水平为(3.5±0.8)mg/dl。
2. HPLC-MS/MS筛查结果：2例患者被筛选为高风险患者，Phe水平分别为8.4 mg/dl和12.1 mg/dl，Phe / Tyr比值分别为2.3和 3.8。HPLC-MS/MS检测的2例高风险病例包含在TRFIA检测的31例高风险病例中。
3. Sanger测序结果：通过Sanger测序进一步分析了筛查出的31例高风险患者。结果显示HPLC-MS/MS和TRFIA均筛查为高风险的2例患者分别是PAH的双重突变杂合子突变体(Y356X×R53H；R241C×IVS4-1G>A)，其余29例仅TRFIA筛查为高风险的患者中有5例PAH的杂合子突变体(IVS12-286A>C IVS12+6T>A、Y204C、R413P和R243Q)。见表1。5例杂合子突变体患儿经随访至今，未发现阳性病例。
表1 7例新生儿的PKU筛查结果和最终测序结果
序号年龄 (d)HPLC-MS/MS检测Phe 浓度 (mg/dl)Phe/TyrTRFIA检测Phe浓度(mg/dl)测序结果突变位点突变类型临床诊断1418.42.311.3R241C错义突变典型PKUIVS4-1 G>A剪接位点突变疑似PKU2322.13.813.9Y356X无义突变典型PKUR53H错义突变疑似PKU351.3<1.52.6IVS12-286A>C剪接位点突变携带者431.5<1.53.4R243Q错义突变携带者541.4<1.53.9R413P错义突变携带者631.1<1.52.9IVS12+6T>A剪接位点突变携带者731.1<1.53.6Y204C错义突变携带者
讨论
新生儿疾病筛查是国家重大缺陷预防战略的重要组成部分，已在各省市广泛实施。区域性新生儿筛查项目于2008年首次引入内蒙古，此后逐步从城市向农村推广，发展成为覆盖内蒙古大部分地区的完整筛查网。在提高项目覆盖率的同时，还需要更新筛选方法，减少假阳性率。
本研究以人群为基础开展PKU筛查，在12 896例新生儿中，2例被鉴定为PKU患者，患病率为1/6 448，5例被鉴定为PAH杂合子变体的携带者。PKU患病率因种族和地区而异：在欧洲人中约为1 / 10 000，其中北爱尔兰为1/4 400，德国为1/7 000[2]。在亚洲地区，日本相对较低(1/120 000)[3]。中国的平均比率约为1/11 188[4]，但南北差异大，南方地区相对较低。据报道，内蒙古的近邻宁夏回族自治区是PKU发病率最高的地区之一(1/3 065)[5]。内蒙古的一份报告显示，PKU的患病率为1/2 069 [6]，而本研究中PKU的患病率为1/6 448，可能是随着产前诊断技术的不断发展以及人群产前诊断意识的不断提高，使得PKU患儿出生率有所下降。
比较国内PAH突变体发现，R243Q、R413P和Y356X是最流行的突变群体，在中国北方地区它们的相对突变率分别为21.7%，6.5%和6.1%[7]；中国汉族人群的相对突变率分别是26%，5%和5%[8]。Zhu等人发现R413P的突变率在南方地区(2.7%)与北方地区(8%)存在显著差异[8]，其次是R241C，突变率在0.7%到5.0%之间。此外，IVS4-1G>A(2.0%)和R53H(2.0%)突变在国内也很常见。而内含子12中的突变IVS12-286A>C鲜有报道，IVS12 + 6T> A突变概率相对较低[9]。
比较亚洲地区PAH突变体发现,R243Q是中国人群最常见的突变之一，在韩国和日本也经常发现这一突变。Y356X的突变概率在中国、日本和韩国相似(6.5%，4.9%和5.7%)[3,10]，而IVS4-1G>A在韩国比在中国和日本更普遍，R241在日本和韩国的频率相对较高，但在中国较低。总的来说，R243Q、Y356X、R413P和IVS4-1G>A属于亚洲地区PAH的常见突变。
PAH突变的基因型与表型的相关性比较明显。大多数突变体可导致三种PKU表型中的一种，包括轻度高苯丙氨酸血症(MHP)、轻度PKU和典型PKU。但在某些突变体中也有例外。例如，R243Q和Y356X常见于典型PKU(85%～91%)，但在轻度PKU中也发现了这两种突变体。类似的情况也发生在PAH等位基因或非等位基因突变IVS4-1G>A，Y356X，R413P上[11-13]。Guldberg等人的假说认为突变蛋白的多种生物学特性和功能导致了这些差异[14]。这些差异对于PKU的诊断是一个挑战。通常建议在患儿接受饮食治疗之前对PKU水平进行明确的评估。大多数情况下，医生必须综合评估患儿在一定时期内的临床表现，以诊治该病。本研究将2例PAH双重突变杂合子的病例确诊为典型PKU，而对于那些仅含有杂合突变体的病例，建议在确诊之前定期检测血液Phe水平，并进行一定时间的随访。
内含子变异产生的影响尚不清楚。为了确定这一特殊突变是否具有致病性，Shapiro等人引入了一个剪接分数计算器，分别评估了ivs12+4a>g和ivs12+6t>a这两种突变对PAH转录的影响[15]。研究表明，与正常基因剪接相比，这两种变体都在很大程度上降低了PAH的剪接分数。由此可以推测，内含子的突变会通过影响剪接位点的识别来降低剪接效率，但其个体表型的影响程度尚需进一步研究确认。
本研究发现，在新生儿疾病筛查项目中，TRFIA和HPLC-MS/MS的检测效果有很大差异。在TRFIA检测中，RFIDA的假阳性率为0.22%(29/12 894)，而在HPLC-MS/MS方法中，未观察到假阳性病例。目前，血液中Phe/Tyr比值已成为诊断PKU的金标准。HPLC-MS/MS已被证实是一种精确的检测特定氨基酸的技术，可用于筛选PKU患者，HPLC-MS/MS较TRFIA方法，其检测氨基酸分子类别更全面。对于PKU筛查而言，除了检测Phe、Tyr浓度，而且其比值对于鉴别诊断PKU和暂时性高苯丙氨酸血症具有重要参考价值。HPLC-MS/MS也适用于定量评价几种生物标志物，用于检测PKU患者的治疗效果，且检测时间较短(每次运行不到5 min)，可以每天检测。值得注意的是，5例杂合变体都是通过TRFIA筛选出的，HPLC-MS/MS检测这5例的Phe/Tyr比值正常。一般来说，突变携带者和正常受试者的血液PHE水平可能有轻微差异。HPLC-MS/MS方法的灵敏度较高，理论上应该检测到这种细微的差异，因此需要做进一步的研究来解释该现象。
综上所述，本研究以HPLC-MS/MS为基础，对内蒙古地区新生儿进行了PKU筛查。与TRFIA检验相比，HPLC-MS/MS方法具有较高的灵敏度和特异度，可作为临床常规筛查诊断方法。本研究发现了5种PKU的杂合变体。其中Y356X、R243Q和R413P的变异是中国北方最常见的突变。此外，还发现了一个内含子的突变体：IVS12-286A>C，这在之前的研究中报道较少。
1 Guthrie R,Susi A.A simple phenylalanine method for detecting phenylketonuria in large populations of newborn infants.Pediatrics,1963,32,338-343.
2 Bickel H,Bachmann C,Beckers R.Neonatal mass screening for metabolic disorders.Eur.J.Pediatr.1981,137,133-139.
3 Aoki K,Wada Y.Outcome of the patients detected by newborn screening in Japan.Acta Paediatr Jpn,1988,30:429-434.
4 Gu XF,Wang ZG.Neonatal screening for phenylketonuria and congenital hypothyroidism in China.Chin J Prev Med,2004,38:99-102.
5 Juan G,Liu Q,Wang S.Investigation of neonatal congenital hypothyroidism and Phenylketonuria between 2007 and 2010 in Ningxia.J Chin Pediatric,2011,26:409-410.
6 冯莉,王晓华,董弘,等.内蒙古地区28964例新生儿疾病筛查结果分析.包头医学院学报,2013,29:16-17.
7 Song F,Qu Y,Yang Y,et al.The mutant spectrum of phenylalanine hydroxylase gene in Northern Chinese.Chin J Med Genet,2007,24:241-246.
8 Zhu T,Qin S,Ye J,et al.Mutational spectrum of phenylketonuria in the Chinese Han population:a novel insight into the geographic distribution of the common mutations.Pediatric Research,2010,67:280-285.
9 Song F,Qu Y,Zhang T,etal.Phenylketonuria mutations in Northern China.Molecular Genetics and Metabolism,2005,86:S107-S118.
10 Lee DH,Koo SK,Lee KS,et al.The molecular basis of phenylketonuria in Koreans,J Hum Genet,2004; 49:617-621.
11 Ellingsen S,Knappskog PM,Eiken HG.Phenylketonuria splice mutation (EXON6nt-96A>G) masquerading as missense mutation (Y204C).Hum Mutat,1997,9:88-90.
12 Ellingsen S,Knappskog PM,Apold J,et al.Divers PAH transcripts in lymphocytes of PKU patients with putative nonsense (G272X,Y356X) and missense (P281L,R208Q) mutations.FEBS Lett,1999,457:505-508.
13 Chao HK,Hsiao KJ,Su TS.A silent mutation induces exon skipping in the phenylalanine hydroxylase gene in phenylketonuria.Hum Genet,2001,108:14-19.
14 Guldberg P,Rey F,Zschocke J,et al.A European multicenter study of phenylalanine hydroxylase deficiency:classification of 105 mutations and a general system for genotype based prediction of metabolic phenotype.Am J Genet,1998,63:71-79.
15 Shapiro MB,Senapathy P.RNA splice junctions of different classes of eukaryotes:sequence statistics and functional implications in gene expression.Nucleic Acids Res,1987,17:7155-7174.