孕妇基因多态性和自发性早产发生风险的关联性研究

【摘要】目的研究8种代谢酶基因单核苷酸多态性(SNPs)以及PM2.5环境污染物与自发性早产发生是否存在关联。方法采用病例对照研究，以2013年3月至2014年12月在北京市海淀区妇幼保健院分娩自发性早产儿的孕妇作为病例组，以同院分娩健康足月儿的孕妇作为对照组。共募集到孕妇308例，排除实验数据缺失者，最终有306例孕妇进入本次研究，其中病例组103例，对照组203例。收集孕妇的基本信息和妊娠情况，同时采集孕妇静脉血测定基因型。以美国国务院公布北京市2013—2014年度每日PM2.5数据作为环境PM2.5暴露资料，采用盐析法提取白细胞DNA，基质支持的激光释放/电离飞行时间质谱(MALDA-TOF MS)检测，分析基因和环境污染对自发性早产的影响。结果病例组和对照组在一般人口学特征和妊娠情况上差异均无统计学意义，两组孕妇在PM2.5暴露程度上差异无统计学意义。参与编码CYP1A2的rs2472304在两组间的基因频率和基因型频率的差异均有统计学意义，Logistic回归发现显性遗传模式下的rs2472304的突变基因型(AA/GA)相较于野生型基因(GG)对早产的发生有保护作用(OR=0.52，95% CI：0.30～0.90)。PM2.5暴露浓度分层分析显示，突变基因型在高浓度暴露时对自发性早产有保护作用。结论 rs2472304的突变与自发性早产的发生有关，未发现环境PM2.5暴露与自发性早产的发生存在关联。

作者单位：100191 北京 ,北京大学生育健康研究所(庞一鸣,刘念,陈小兰,王斌,李智文)；北京市海淀区妇幼保健院(王佳楣,刘晓红)

Association between risk of spontaneous preterm birth and single nucleotide polymorphism

PANG Yiming, WANG Jiamei, LIU Nian, CHEN Xiaolan, LIU Xiaohong, WANG Bin, LI Zhiwen. Institute of Reproductive and Child Health, School of Public Health, Peking University, Beijing 100191, China; Haidian District Maternal and Child Health Hospital, Beijing 100080, China

[Abstract] Objective To study the association between spontaneous preterm birth (SPB) and its potential risk factors including single nucleotide polymorphism (SNP) of metabolism enzyme and the ambient exposure to PM2.5. Methods A case-control study was conducted based on the patients in the Haidian District Maternal and Child Health Hospital from March 2013 to December 2014. The cases were SPB women, and mothers with term delivery acted as controls. Population characteristics, pregnancy information and venous blood were also collected. The ambient concentrations of PM2.5 were obtained from U.S. embassy monitor in Beijing. DNA was extracted by salt-out method and genotyped by Matrix assisted laser desorption ionization/time of flight mass spectrometry (MALDA-TOF MS). Statistics of the between-group comparison were calculated to explore the risk factors of SPB. Results Population characteristics and pregnancy conditions were similar between the case and control group (P>0.05). The exposure level of PM2.5 was similar, as well (P>0.05). Either allele or genotype frequency of rs2472304, a SNP of CYP1A2 was significantly different between the case and control group (P<0.001). Based on the results of the logistic regression, we found the mutant genotype of rs2472304 (AA/GA) had a protective effect on SPB, compared to the wild genotype (GG). Based on the model on the interaction between PM2.5 exposure and the SNP, the protective effect of the mutant genotype was stronger under more polluted scenario. Conclusion The mutation of rs2472304 was associated with SPB. We didn’t found a significant association between PM2.5 exposure and SPB.

[Key words] spontaneous preterm birth； single nucleotide polymorphism； SNPs； PM2.5

早产(preterm birth)是指妊娠不满37周的分娩，其上限全世界是统一的，但下限各个国家有所不同，这与各国新生儿治疗水平有关。中国采用的是妊娠满28周作为早产的下限[1]。根据早产的临床分娩特征，可以分为自发性早产(spontaneous preterm birth)和医源性(诱发性)早产，前者包括了胎膜完好的自发性早产(spontaneous preterm with intact membranes)和未足月胎膜早破(preterm premature rupture of the membranes，PPROM)。又根据孕龄的不同[2]，分为早期早产(孕28～31周分娩)、中期早产(孕32～33周分娩)和晚期早产(孕34～36周分娩)，亦有极早早产(<孕28周分娩)这一分类。

早产是一个全球范围内的重要公共卫生问题，是全球新生儿死亡的首要原因，且在近年来超过肺炎，发展成五岁以下儿童死亡的首要原因[3]。在所有早产的发病中，自发性早产所占比例超过6成[4]。自发性早产的确切病因尚不明确，有研究指出，孕妇基因多态性[5]是影响自发性早产的可能因素之一，环境空气污染物，如PM2.5、二氧化氮等对孕期的健康影响也获得了研究者的关注[6]。在国内，仅有有限的研究，研究汉族人群基因多态性与自发性早产，关于环境空气污染与自发性早产的研究尚未见报道。因此，本文根据2013—2014年在北京市海淀区妇幼保健院开展的自发性早产病例对照研究，探究代谢酶基因多态性以及孕早期环境中空气PM 2.5污染暴露对自发性早产发生的影响，为进一步阐明早产的病因，从源头上防治自发性早产提供新的思路。

对象和方法

一、对象

采用病例对照研究，以2013年3月—2014年12月在北京市海淀区妇幼保健院发生自发性早产的孕妇作为病例，每招募一个病例，会招募同期在本院分娩健康足月儿的孕妇作为对照。此次研究共募集到孕妇308名，排除实验数据缺失者，共有306例孕妇进入本研究，其中病例组103例，对照组203例。

自发性早产的诊断标准为孕28～36周分娩，并排除妊娠并发症等明确原因引起的早产者。病例组的入选标准为年龄20～40岁，怀孕期间一直生活在北京的单胎活产孕妇，排除孕期患有重大疾病者以及吸烟者。对照组的选择为同一医院自然分娩足月新生儿(孕周≥37周)的产妇，除满足病例组的标准外，还应与病例组产妇年龄相差三岁以内，且婴儿性别相同。研究对象的招募和血标本采集均经本人知情同意，研究方案通过北京市海淀区妇幼保健院伦理审查。

二、方法

1.孕妇基本资料采集：通过北京市海淀区妇幼保健院门诊电子病历系统采集，主要包括孕妇的一般情况、既往生育史、患病史和此次妊娠情况等，如孕妇年龄、身高和体重、职业、出生日期、文化程度和婚姻状况；既往孕产史，有无重大疾病；末次月经日期、分娩日期、分娩孕周、新生儿性别以及单双胎等。

2.标本采集、DNA提取和基因型鉴定：北京市海淀区妇幼保健院护士按照临床操作规程采集孕妇肘部静脉血5 ml，经乙二胺四乙酸抗凝后放入采血管中进行离心，吸去上层血浆后获得孕妇血细胞样本，并于-80℃冻存。孕妇血细胞样本采用盐析法提取DNA，其浓度和纯度经紫外/可见分光光度计进行检测，纯度要求OD260/280在1.8～2.0之间。基因型由基质支持的激光释放/电离飞行时间质谱分析(MALDL-TOF MS)。以对照组中测得的最高频率的基因作为该基因位点的野生型基因，其他则作为突变型基因。为保证实验质量，随机抽取10%的样品进行二次检验。

3.孕早期PM 2.5暴露水平的计算：采用美国国务院公布的美国驻北京大使馆监测北京市2012—2014年PM2.5每日逐时浓度[7]作为环境暴露指标来源。根据逐时PM2.5浓度计算24 h平均浓度作为每日PM2.5暴露浓度。计算以校正末次月经之日起90 d的每日PM2.5暴露浓度的平均值，作为PM2.5孕早期平均暴露浓度。

4.统计学处理：采用Epidata软件进行数据平行双录入。在对SNPs进行统计学检验时，为降低多重比较产生的假阳性，需对检验水准进行Bonferroni校正，以P<0.05/SNPs数量为差异有统计学意义。使用PLINK 1.07软件检验基因的Hardy-Weinberg平衡，等位基因频率的分布和差异，以及基因型频率和遗传模型。

应用SPSS 20.0软件中的χ2检验对研究对象一般情况进行描述和分析，以P<0.05为差异有统计学意义。采用 Logistic回归模型进行分层分析，根据PM2.5暴露浓度的不同，以PM2.5浓度≤100 ng/m3为低暴露组，以浓度>100 ng/m3为高暴露组，检验不同暴露水平下代谢酶基因多态性与早产结果的关系。

结果

一、一般人口学和妊娠情况

研究对象年龄21～38岁，平均年龄为(29.7±2.7)岁，平均孕周为(37.5±2.3)周。其中病例组平均年龄(29.8±3.0)岁，平均孕周(34.7±1.7)周；对照组平均年龄(29.7±2.6)岁，平均孕周(38.9±1.0)周。研究对象中， 88.9%(272/306)为初次生产，56.9%(174/306)为首次怀孕。在病例组中，晚期早产共84人(81.6%，84/103)，中期早产14人(13.5%，14/103)，早期早产5人(4.9%，5/103)，无极早早产发生。

两组孕妇之间的一般人口学特征和妊娠情况比较，差异均无统计学意义，两组间均衡可比。见表1。

二、SNPs的等位基因频率和遗传模型分布

1. 等位基因分型和Hardy-Weinberg平衡：本研究共检测了3个一相代谢基因的5个SNPs位点以及3个二相代谢基因的3个SNPs位点。各位点等位基因检测的应答率均为100%，MAF值均>1%，在对照组中进行的Hardy-Weinberg平衡检测显示各位点基因型均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。见表2。

2.各SNPs等位基因在病例组和对照组的分布:各SNPs位点等位基因频率的分布见表3。仅有rs2472304(CYP1A2)的等位基因频率在两组间的分布差异有统计学意义。由于共涉及8个SNPs位点，因此经Bonferroni校正后的检验水准P`=0.05/8=0.037。此时rs2472304组间差异有统计学意义，其他各SNPs组间差异均无统计学意义。

Table 1 Comparison of maternal characteristics and pregnancy information between the control and case group [n(%)]

aThe detection rate of genotyping；bMinor Allele Frequency；cBased on the control group

3.rs2472304在两组间的基因型频率及不同遗传模型下与早产的关系:发现该SNP的基因型在两组间差异有统计学意义，进一步计算发现其与早产的发生存在关联。其关联在共显性模型和显性模型下差异均有统计学意义，但由于在计算共显性模型时，rs2472304在病例组中的突变纯合型(AA)数量为0，在计算时可能会存在假阳性的结果，因此，该SNPs的可能遗传方式是显性模型遗传。在该模型下，携带AA/AG基因型个体较携带野生型基因(GG)基因型个体发生早产的危险度降低(OR = 0.52，95% CI：0.30～0.90)。见表4。

4.孕早期不同环境PM2.5暴露水平下rs2472304对早产的影响:

(1)PM2.5的暴露。研究对象孕早期PM2.5暴露浓度的中位数和四分位数间距(IQR)为101.1 [82.4，133.5]ng/m3，其中病例组为101.1 [82.4，118.2]ng/m3，对照组为101.1 [82.2，137.3]ng/m3，两组的浓度差异经Mann-Whitney U秩和检验,差异未见统计学意义(P=0.732)。

(2)不同暴露水平下rs2472304对早产的影响。以显性模型作为rs2472304的遗传模型，对孕早期不同暴露环境下基因多态性与自发性早产发生风险做分层分析。在较低PM2.5暴露浓度时，rs2472304未见关联(OR = 0.65，95% CI：0.30～1.37)；但在较高PM2.5暴露情况下，该SNPs与早产的发生有关(OR = 0.40，95% CI:0.18～0.92)，突变型对早产的发生有保护作用,经年龄和BMI调整后，差异仍保留统计学意义(OR = 0.39，95% CI:0.17～0.90)。见表5。

讨论

环境因素是导致孕妇发生早产的重要因素，早产已被证明与PM2.5污染物的暴露存在关联[8], 有研究指出，中国约30%～40%的早产率升高需归因于PM2.5的高暴露，而同期美国仅有2%[9]。但是，关于自发性早产这一早产类型与环境PM2.5暴露的研究很少。本研究检验了这一关系，但并未发现PM2.5的孕早期暴露与自发性早产的发生存在关联，这与2016年美国纽约开展的一项研究结果类似[6]。虽然本研究中并未发现PM2.5是导致自发性早产的危险因素，但既往有研究发现，该物质的暴露仍然会增加总早产和其他不良妊娠结局的发生风险[8]，孕妇在妊娠期也应全程减少暴露于过高浓度的PM2.5。

已有几种基因被研究者证实影响了自发性早产的发生，其中一些参与编码人体一相和二相代谢酶的SNPs发现与自发性早产的发生存在关联[10-11]。本研究发现，CYP1A2基因中的rs2472304的多态性与自发性早产的发生有关，携带突变基因(AA/GA)的孕妇发生早产的风险降低。CYP1A2基因编码细胞色素P450-1A2酶，是人体重要的一相代谢酶，参与体内多种药物和环境有害物质代谢，其活性和表达水平可受多种因素影响，而其基因多态性起着重要的作用。既往的研究发现，rs2472304的 G/A突变会影响人体对外源性物质如某些精神类药物的代谢，该位点携带突变基因A的研究对象相较于携带野生基因G的研究对象体内药物浓度会显著降低，说明该突变可以提高一相代谢水平，促进外源性物质的代谢[12]。本研究发现，该位点的突变对自发性早产的发生也存在一定的保护作用，可能与该突变增加了孕妇对体内污染物的代谢能力，减少污染物内暴露有关。本研究接下来的分层分析中发现，在PM2.5孕早期暴露水平较低的孕妇中，该突变并未观察到作用；但在暴露水平较高的孕妇中，该突变显示了减少早产发生的保护作用。这说明在较高浓度的PM2.5暴露下，相比于野生型基因，该突变引起的一相代谢速率提高使得孕妇机体得以更加迅速的清除体内的PM2.5以及伴随的其他外来污染物，进而减轻了人体因暴露于PM2.5而引起的炎性反应和氧化应激反应，对预防早产的发生起到了一定的保护作用。值得注意的是，该基因在全球不同种族的人群中分布具有极大的差异性，根据国际千人基因组计划的测定[13]，在早产发生率较低的白种人群中，突变基因A的基因频率在0.6以上；而在早产发生率较高的亚非人群中，突变基因A的基因频率不足0.16。虽然需要考虑到白种人群和亚非人群的巨大社会经济差异，但基因频率的差异在rs2472304在自发性早产的发生中起到的作用仍然值得进一步研究。

综上所述，本研究发现，参与编码CYP1A2的rs2472304的突变基因与自发性早产的发生存在关联；在不同PM2.5暴露浓度下，该突变显示出在较高污染暴露状况下对自发性早产有保护作用。

1 中华医学会妇产科学分会产科学组.早产临床诊断与治疗指南(2014).中华围产医学杂志,2015,4:241-245.

2 Frey HA,Klebanoff MA.The epidemiology,etiology,and costs of preterm birth.Semin Fetal Neonatal Med,2016,2:68-73.

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5 Monangi NK,Brockway HM,House M,et al.The genetics of preterm birth:Progress and promise.Semin Perinatol,2015,8:574-583.

6 Johnson S,Bobb JF,Ito K,et al.Ambient Fine Particulate Matter,Nitrogen Dioxide,and Preterm Birth in New York City.Environ Health Perspect,2016,8:1283-1290.

7 U.S.Department of State.U.S.Department of State Air Quality Monitoring Program.2019.http://stateair.net/web/post/1/1.html

8 Guo T,Wang Y,Zhang H,et al.The association between ambient PM2.5 exposure and the risk of preterm birth in China:A retrospective cohort study.Sci Total Environ,2018,1453-1459.

9 Malley CS,Kuylenstierna JC,Vallack HW,et al.Preterm birth associated with maternal fine particulate matter exposure:A global,regional and national assessment.Environ Int,2017,173-182.

10 Sheikh IA,Ahmad E,Jamal MS,et al.Spontaneous preterm birth and single nucleotide gene polymorphisms:a recent update.BMC Genomics,2016,Suppl 9:759.

11 Luo YJ,Wen XZ,Ding P,et al.Interaction between maternal passive smoking during pregnancy and CYP1A1 and GSTs polymorphisms on spontaneous preterm delivery.PLoS One,2012,11:e49155.

12 Song L,Du Q,Jiang X,et al.Effect of CYP1A2 polymorphism on the pharmacokinetics of agomelatine in Chinese healthy male volunteers.J Clin Pharm Ther,2014,2:204-209.

13 NCBI.rs2472304 RefSNP Report.2019.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/rs2472304#frequency_tab