表1 灵敏度计算用表
Table 1 The table for the calculation of sensitivity index
Combined probe anchoragepolymerization sequencing Sanger sequencingPositiveNegativepositiveA (positive)B (false positive)negativeC (false negative)D (negative)
·遗传与出生缺陷·
遗传因素耳聋患者大约占耳聋人群的60%以上[1-2]。国内听力残疾流行病学研究表明，80%以上遗传性耳聋患者携带的突变基因多集中在GJB2、GJB3、SLC26A4及线粒体12S rRNA上。目前临床实验室多用耳聋基因芯片检测试剂盒来检测遗传性耳聋，基因检测位点包含9个或15个位点，适用于临床上的一般筛查。但是，对于罕见耳聋基因上的异常，以及大规模的新生儿耳聋基因筛查，芯片法有其明显的不足。目前高通量测序是临床医学基因检测的先进技术，适应于大规模的临床基因检验，而且精准快速。但高通量测序技术应用于临床进行遗传性耳聋基因检测，目前无实验室开展，该技术及相应试剂盒无临床检验资质。本研究拟通过应用基于高通量测序的联合探针锚定聚合测序法来检测临床标本，对测序结果进行Sanger测序验证，同时与目前流行的基因芯片法进行比对，综合探索联合探针锚定聚合测序法的临床应用价值，为联合探针锚定聚合测序法申报临床检验资质提供有力数据。
选取内蒙古自治区妇幼保健院遗传优生科耳聋基因检测标本库已知为遗传性耳聋基因检测结果异常标本35例。35例患儿中女性15例，男性20例，出生体重均在2 500克以上，出生孕周≥37周。出生后48～72 h内采足底血制作干血滴滤纸片用于基因检测。患儿父母或监护人均已签署基因测序知情同意书。
1.标本采集：采用干血滴滤纸片法，在患儿足跟部采血，并滴于采血纸片上，形成一个或数个均匀血斑，自然风干后即可进行检测。标本如不能及时检测，则暂时密封于-20 ℃冰箱中待检。
2.干血片样本基因组DNA提取：使用打孔器制作6 mm的干血片，放入1.5 ml离心管，使用Qigan干血片核酸提取试剂盒提取样本基因组DNA，DNA浓度经测定，在20～50 ng/μl为宜，-20 ℃暂存。
3.联合探针锚定聚合测序法分析：
(1)文库制备。对提取的基因组DNA样本通过打断修复，接头连接，PCR扩增进行文库制备。配制打断修复混合液，将基因组DNA打断修复。按标本数量每个标本分别加入15 μl标签接头，接头与模板DNA结合，使每个模板都有特定标签并纯化；对模板进行PCR扩增，PCR扩增程序：94 ℃ 120 s，1个循环；94 ℃ 20 s，56 ℃ 30 s，60 ℃ 20 s，35个循环；72 ℃ 300 s，1个循环；12 ℃暂存。扩增产物纯化并测浓度，浓度≥ 2 ng/μl为合格。
(2)测序反应。使用测序反应通用试剂盒(联合探针锚定聚合测序法，湖北华大生物科技)在基因测序仪(BGISWEQ-500，深圳华大)上进行测序。
(3)数据分析。数据下机后进行信息分析。首先对下机的原始数据(raw reads)进行测序质量评估，去除低质量以及被接头污染的reads。随后用BWA软件(Burrows Wheeler Aligner)与HG19/HG20进行序列比对，与此同时进行序列捕获效果评价，用GATK软件进行SNV(single nucletide variant)和Indel(insertion and deletion)的查询，生成目标区域碱基多态性结果，随后进行数据库(NCBI dbSNP, HapMap, 1000 human genome dataset 和 database of 100 Chinese healthy adults)的比对，并对找出的可疑突变进行注释、筛选。应用遗传性耳聋基因分析软件，按照测序后数据分析标准流程操作，至少两人对测序数据进行分析整理，并核对。
4.芯片法分析(十五项遗传性耳聋相关基因检测试剂盒，博奥生物)：
(1)核酸扩增。将含有十五个突变位点的15组引物分装在三组核酸扩增体系内，每组25 μl 扩增体系 (5 μl DNA模板)，PCR扩增程序：37 ℃ 600 s，1个循环；95 ℃ 900 s，1个循环；95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，70 ℃ 45 s，35个循环；60 ℃ 600 s，1个循环。扩增产物12 ℃暂存。
(2)杂交。三个体系PCR产物各20 μl混匀，加入磁珠混悬液30 μl，静止结合10 min，吸液；120 μl 0.1 M NaOH变性10 min，吸液；杂交盒沟槽加入100 μl超纯水，杂交缓冲液20 μl，吹打混匀，取15.5 μl加到芯片点阵上，密封杂交盒，50 ℃芯片杂交仪60 min。
(3)洗涤，干燥。杂交结束前10 min配置吸液，洗涤并干燥后的芯片，进入芯片扫描仪(LurScan-10K/B)，在DeafTest-15系统中读取杂交位点结果。
(4)结果判读。结果由晶芯十五项遗传性相关基因检测分析系统自动判读，由于产品对所检测的15个位点野生型和突变型分别设计了引物和探针，因此该芯片可同时检测到这15个位点的野生型和突变型结果。当探针的检测信号值大于或等于该探针的覆盖值时，判读该探针为阳性；当探针的检测信号值小于该探针的覆盖值时，判读该探针为阴性。
5.Sanger法验证：对于所有发现的致病突变，在其所在片段上下游设计引物。进行PCR扩增，对产物做Sanger测序，所得结果与检测基因标准序列进行比对，从而验证基因芯片捕获和高通量测序的结果。
6. 灵敏度计算公式：以Sanger测序结果为金标准，根据表1计算联合探针锚定聚合测序法的灵敏度。灵敏度=A/(A+C)×100%。
表1 灵敏度计算用表
Table 1 The table for the calculation of sensitivity index
Combined probe anchoragepolymerization sequencing Sanger sequencingPositiveNegativepositiveA (positive)B (false positive)negativeC (false negative)D (negative)
应用联合探针锚定聚合测序法对35例标本基因组DNA进行分析，35例结果均有异常，突变集中在GJB2、GJB3、SLC26A4和线粒体12S rRNA四个基因上。其中GJB2基因35delG、176_191del16、299_300delAT位点各有2例杂合突变，235delC位点杂合突变1例，纯合突变1例；GJB3基因538C>T杂合突变2例；SLC26A4基因1174A>T、1226G>A、1229C>T、1975G>C、2027T>A、2168A>G、IVS15+5G>A和IVS7-2A>G位点各有2例杂合突变；线粒体12S rRNA基因1494C>T位点1例异质突变型，4例均质突变型，1555A>G位点1例异质突变型，3例均质突变型。见表2。
表2 联合探针锚定聚合测序法35例标本的检测结果
Table 2 Results of combined probe anchorage polymerization sequencing in 35 samples
GenesMutationsitesDescriptionNumber of heterozygousmutationsNumber of homozygousmutationsGJB23535delG2176_191176_191del162235235delC11299_300299_300delAT2GJB3538538C>T2SLC26A411741174A>T212261226G>A212291229C>T219751975G>C220272027T>A221682168A>G2IVS7-2IVS7-2A>G2IVS15+5IVS15+5G>A2Mitochondrial 12S rRNA14941494C>T1415551555A>G13
应用Sanger测序对检验结果进行验证，结果与联合探针法检测一致。联合探针法灵敏度为100%。
应用芯片法检测35例样本，见图1，结果与联合探针法检测一致。
耳聋是一种普遍高发的听力障碍性疾病，环境因素、遗传因素均可导致耳聋的发生。遗传性耳聋有几个较为常见的热点突变，其中中国人群常见耳聋突变主要包括GJB2、GJB3、SLC26A4以及线粒体的12S rRNA基因突变[3-5]。近年来，临床上采用听力筛查与基因检测相结合的方法，有助于临床早期发现处于语前听力损失、迟发性或药物致聋型的高危患者，并通过及时干预与治疗降低耳聋高危人群的发病率。基因检测可快速诊断遗传性耳聋病因，将耳聋基因检测应用于新生儿听力筛查与诊断、产前诊断、孕前体检，是分子技术向临床应用转化的重要途径[6]。
图1 芯片检测位点异常杂交结果
Figure 1 Abnormal hybridization result of chip detection site(Het is short for heterozygous and hom is short for homozygous)
联合探针锚定聚合测序法，根据遗传性耳聋基因突变位点序列信息，设计特异性扩增引物，利用多重PCR技术，扩增基因组DNA中靶序列，同时引入用于样本识别的样本标签序列。将PCR产物按比例混合成为一个文库样本，经过一系列文库制备过程，每个文库样本中的DNA序列都加上了用于测序及文库识别的接头序列。将适量文库样本按等物质的量比例混合为一个测序样本。基因测序仪对测序样本DNA进行序列信息读取，每一条DNA的测序结果经过文库接头序列及样本标签序列比对拆分后将被精确定位到每一个样本中，将每个样本的测序结果与人类基因组比对，并对耳聋基因的突变位点进行数据分析，从而确定耳聋基因位点的检测结果。联合探针锚定聚合测序法优点是：(1)高通量。可同时检测上百个样本，适用于临床人口大范围的耳聋基因筛查。(2)基因组水平的筛查。除了遗传性耳聋涉及的常见基因及特定位点，联合探针锚定聚合测序法可以覆盖整个基因组，结合目前国内外所有报道过的耳聋基因序列，可设计特异引物，来筛查临床难以发现的致病基因的遗传性耳聋[7]。因此，联合探针锚定聚合测序法可以根据临床要求，调整待测基因引物，即可以大范围地检测耳聋基因panel，也可以根据患者临床症状及病史，有针对性地检测和表型相关的基因。这符合目前国家精准化医疗的理念。(3)对标本DNA含量要求低。联合探针锚定聚合测序法的操作中有文库制备，其目的是对标本中基因组DNA进行扩增，来增加测序的深度。这特别适合样品采集困难的患者，比如对新生儿的足底干血片制作。
联合探针锚定聚合测序法的主要局限是成本问题。由于高通量测序仪的使用及维护成本较高，该方法适宜于一次进行上百例的检测。如果单次检测量少，会增加检测的费用。因此，该方法更适用于面对大人口基数检测任务的耳聋基因筛查机构。
本次试验主要是应用临床实验室常用的耳聋检测技术微阵列芯片技术(十五项)和基因测序“金标准”Sanger测序来分别验证联合探针锚定聚合测序法在遗传性耳聋基因检测方面的准确性、灵敏度[8-10]。联合探针锚定聚合测序法的检测结果显示35例标本全部为阳性，涉及4个基因17个位点，与微阵列芯片检测法结果一致，并经Sanger测序验证，其灵敏度达到100%。
本研究通过对联合探针锚定聚合测序法的验证试验，证实了联合探针锚定聚合测序法临床实验室检测的可应用性，可进一步在省级以上耳聋基因检测实验室推广，便捷的高通量检测方法可以更好地服务临床，为耳科医生提供可靠数据支持，为患者提供更全面的检测。
1 余红,刘丹,杨晶群,等.新生儿听力和常见耳聋基因联合筛查的临床实践.中国优生与遗传杂志,2015,23:77-78.
2 李琦,宋建敏,刘亚青,等.新生儿听力筛查未通过者的基因诊断.中华耳科学杂志,2014,12:37-38.
3 王国建,张冠斌,袁永一,等.十五项遗传性耳聋基因突变微阵列诊断芯片的临床应用.中华耳科学杂志,2014,12:6-10.
4 徐百成,郭玉芬,王秋菊.常染色体隐性遗传非综合征性耳聋基因研究进展.中华耳科学杂志,2006,2:140-145.
5 赵立东,王秋菊,郭维维,等.与线粒体DNA A1555G突变有关的非综合征型耳聋.中华耳科学杂志,2004,2:136-141.
6 韩冰,戴朴,戚庆伟,等.缝隙连接蛋白相关性耳聋和大前庭水管耳聋家庭的产前诊断和生育指导.中华耳鼻咽喉头颈外科杂志,2007,42:660-663.
7 孙菲菲,胡松群,张洁,等.高通量基因捕获测序技术在一遗传性耳聋大家系中的应用.中华耳科学杂志,2017,15:57-60.
8 袁永一,戴朴.耳聋基因诊断——转化医学推动耳科学发展范例.中华耳科学杂志,2014,12:1-5.
9 江凌晓,凌月仙,蔡桂君,等.遗传性耳聋基因芯片检测的临床应用研究.分子诊断与治疗杂志,2011,3:170-172.
10 张昊昱,张宁,张华,等.耳聋基因检测在遗传性耳聋诊断及遗传咨询中的应用.中华耳科学杂志,2016,14:639-643.