利用胚胎实时监测形态动力学参数预测胚胎种植结局

【摘要】目的探索影响胚胎种植结局的胚胎形态动力学参数和胚胎发育特殊分裂模式，以提高体外受精-胚胎移植(IVF-ET)周期的临床结局，缩短治疗周期。方法回顾性分析江苏省苏州市立医院生殖与遗传中心2016年7月到2017年12月212例IVF-ET周期胚胎实时监测(Time-lapse)观察培养的273枚胚胎，其中女方年龄<35岁，143个周期185枚胚胎(其中种值86枚，未种植99枚)；女方年龄≥35岁，69个周期88枚胚胎(其中种植30枚，未种植58枚)。探讨胚胎形态动力学指标(t2、t3、t4、t5、t8、cc2、cc3、s2和s3)以及胚胎发育特殊分裂模式(AC、RC和MN)与胚胎种植的相关性。结果在所有273枚胚胎中，种植116枚，未种植157枚，种植组的女方年龄、s2以及AC显著小于未种植组(P均<0.05)；对于女方年龄<35岁的患者，种植组<35岁的s3和AC显著低于未种植组<35岁(P<0.05)，其余指标组间差异无统计学意义；对于女方年龄≥35岁的患者，种植组≥35岁的s2显著低于未种植组≥35岁(P<0.05)，其余指标组间差异无统计学意义。结论胚胎形态动力学参数s2、s3和特殊分裂模式AC与不同年龄患者的胚胎种植潜能具有一定相关性。

【关键词】胚胎实时监测技术；胚胎；种植；形态动力学；异常分裂

基金项目：江苏省妇幼健康科研项目(F201820)；江苏省妇幼重点人才(FRC201725)；江苏省医学创新团队(CXTDB2017013)；苏州市临床医学中心(SZZX201505)

作者单位：215002 江苏苏州，南京医科大学附属苏州医院，苏州市立医院生殖与遗传中心

自1978年世界首例试管婴儿诞生以来，体外受精-胚胎移植(IVF-ET)技术取得了飞速发展，但是随之而来的是多胎率的升高，母婴健康安全受到威胁。那么如何降低IVF-ET技术的多胎率呢？其关键技术是选择性单胚胎移植技术(eSET)，因此，如何选择一个最具种植潜力的胚胎是当前亟待解决的问题。

目前，传统形态学评分是最常用的胚胎评估方法，但是需要将胚胎反复取出培养箱，只能观测胚胎发育的某些时间点。而近年来兴起的胚胎实时监测技术(Time-lapse Monitoring，TLM)可以对胚胎进行实时动态监测，获得胚胎连续动态发育图谱，观测胚胎发育过程中的异常发育行为，进而为选择高发育潜能胚胎提供更多参考信息。研究表明，利用Time-lapse得到的早期胚胎发育分裂时间点和异常发育行为可以预测囊胚形成和胚胎种植结局[1-3]，但是由于胚胎发育受培养体系和培养环境的影响较大[4]，仍需探索适合本实验室的预测模型。

本研究分析了胚胎形态动力学图谱和异常发育行为对胚胎种植结局的影响，试图利用Time-lapse寻找本中心培养体系和培养环境下预测早期胚胎种植力的指标，以缩短胚胎体外发育时间，提高临床妊娠结局。

材料与方法

1.对象：江苏省苏州市立医院生殖与遗传中心2016年7月到2017年12月，移植次数小于等于3次的IVF-ET周期，共212周期273枚胚胎，其中种植116枚(种植组)，未种植157枚(未种植组)。患者年龄<35岁，143个周期185枚胚胎，其中种植86枚(种植组<35岁)，未种植99枚(未种植组<35岁)，种植率46.5%；患者年龄≥35岁，69个周期88枚胚胎，其中种植30枚(种植组≥35岁)，未种植58枚(未种植组≥35岁)，种植率34.1%。

(1)取卵受精。患者进行常规促排卵(长方案或拮抗剂方案)，长方案患者在黄体中期或口服避孕药停药前5～7 d使用醋酸曲普瑞林(辉凌医药)0.05 mg/d，在第15天测激素水平和B超后开始使用注射用重组人促卵泡激素(Merck Serono)，待优势卵泡达18～20 mm时，注射6 500 IU注射用重组人绒毛膜促性腺激素(默克公司)；拮抗剂方案患者月经2～3 d开始注射用重组人促卵泡激素(Merck Serono)，3～5 d后测激素水平和B超，当卵泡直径13～14 mm，加用促性腺激素释放激素拮抗剂(GnRH-ant，默沙东有限公司)0.25 mg/d，待优势卵泡达18～20 mm时，注射0.2 mg醋酸曲普瑞林(辉凌医药)或2 000～40 000 IU注射用人绒毛膜促性腺激素(丽珠医药)+0.1 mg醋酸曲普瑞林(辉凌医药)，注射34～36 h后在阴道B超引导下取卵，获得的卵丘卵母细胞复合物洗涤干净后置于含蛋白的受精液(Vitrolife公司，瑞典)，4～6 h后行IVF或ICSI。

(2)胚胎培养。受精后的2PN胚胎放入 Embryoslide培养皿(Vitrolife，丹麦)，置于Embryo Scope 时差培养箱(Vitrolife，丹麦)进行培养，培养液为Global Total(Life Global，美国)，培养箱环境为6.0% CO2、5.0% O2、37 ℃。设置拍摄间隔为10 min，连续拍摄6 d。

(3)Time-lapse监测系统和胚胎评分。运用Viewer D图像分析软件，收集2PN 胚胎资料，记录每个胚胎的原核消失时间( tPNf) 和2细胞、3细胞、4细胞、5细胞、8细胞的细胞分裂时间点(t2、t3、t4、t5、t8)，同时观察胚胎发育异常行为，包括异常分裂(abnormal cleavage，AC)、逆分裂(reverse cleavage，RC)和多核(multinucleation，MN)。评价胚胎形态动力学的变量包括t2、t3、t4、t5、t8、cc2(t3～t2)、cc3(t5～t3)、s2(t4～t3)和s3(t8～t5)，并以tPNf作为胚胎发育的相对起点，以消除IVF和ICSI的受精时间差异[5]。

(4)临床结局。移植后14 d测血β hCG，阳性者于4～6周后B超检查，见孕囊者为临床妊娠。

(5)统计学处理。采用SPSS16.0软件进行统计学分析，组间均数比较符合正态分布的采用t检验，不符合正态分布的采用秩和检验；率的比较采用卡方检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1.形态动力学参数指标与种植的关系：由表1可知，移植次数小于等于3次的IVF-ET周期中，种植组的女方年龄、s2和AC显著小于未种植组(P<0.05)，而s3和RC小于未种植组，但差异无统计学意义，其余指标组间差异均无统计学意义。

2.形态动力学指标与年龄<35岁患者种植的关系：由表2可知，对于年龄<35的患者，种植组<35岁的 s3和AC显著小于未种植组<35岁(P<0.05)，其余指标组间差异均无统计学意义。

3.形态动力学指标与年龄≥35岁患者种植的关系：由表3可知，对于年龄≥35的患者，种植组≥35岁的 s2显著小于未种植组≥35岁(P<0.05)，其余指标组间差异均无统计学意义。

4.多种异常分裂行为联合对患者妊娠结局的作用：由表4可知，无论是单纯AC还是AC联合其他异常分裂行为，其种植率都显著低于无异常分裂行为(P均<0.05)，而除AC的其余异常分裂行为(RC、MN或两者联合)对种植率无显著影响(P>0.05)。另外，AC联合其他异常分裂行为组的种植率和单纯AC组的种植率之间无显著差异(P>0.05)。因此，在本研究中，RC、MN和AC在胚胎发育过程中联合出现，并不能加大对胚胎种植的负作用。但后续需扩大样本，进一步研究AC与非整倍体的相关性。

讨论

自1997年Payne等[6]首次将TLM应用于临床，已有许多研究证实，利用TLM可以选择出更具发育潜能的胚胎[1-3]。与传统形态学评估比，TLM能得到更多胚胎发育详细信息，且这些信息主要集中于胚胎发育前3 d。因此，可以更早的选出优质胚胎进行移植，以减少因囊胚培养失败导致的取消周期，减少胚胎在体外的培养时间，进而避免可能产生的表观遗传学改变。

本研究探讨了胚胎早期发育的形态动力学参数和特殊分裂模式对胚胎种植潜能的影响，结果表明，女方年龄、s2和AC是影响种植率的3个指标。进一步，为了消除年龄对种植结局的影响，将胚胎根据女方年龄分组，结果发现年龄<35岁患者，种植组<35岁和未种植组<35岁女方年龄间无显著差异，但是种植组<35岁的s3显著小于未种植组<35岁，即从5细胞到8细胞的发育时间更短，发育速度更快，种植率更高。女方年龄≥35岁患者，种植组≥35岁与未种植组≥35岁女方年龄亦无显著差异，但是种植组≥35岁的s2显著小于未种植组≥35岁，即从3细胞发育到4细胞所需发育时间越短，发育速度越快，胚胎种植率越高。本研究与樊玲艳的结果一致[7]，但Meseguer等[8]研究等认为t5、s2和cc2与种植率相关。各研究之间的差异可能的原因是培养环境和培养条件对胚胎生长发育的影响[4]。另外，在本研究中，值得注意的是，s2的标准差均大于平均数，说明数据的离散性比较大，因此s2是否能预测年龄≥35岁患者的种植结局，仍需进一步研究。胚胎发育过程中的特殊分裂模式主要有3种，即(1)异常分裂AC，即由1个细胞直接分裂为3个；(2)逆分裂RC，即分裂的细胞重新融合在一起；(3)多核MN，即一个卵裂球细胞核的数目大于1。

本研究中，对于年龄<35岁患者，种植组<35岁的AC显著小于未种植组<35岁；而对于年龄≥35岁组，种植组≥35岁的AC为10%，小于未种植组≥35岁(12.1%)，但差异不显著(P>0.05)。此结果与大多数以往研究一致[7,9-10]，Zhan等[11]分别观察了第一、第二、第三次分裂时发生的AC，发现AC出现的越早，其非整倍性发生的概率越高。AC的发生可能与纺锤体异常和精子中存在多余的中心粒相关。因此，异常的纺锤体和中心粒导致有丝分裂过程发生紊乱，进而影响胚胎的整倍性。此外，笔者之前对D3细胞数≥6，且胚胎碎片≤20%的胚胎进行囊胚培养发现，AC显著影响囊胚和优质囊胚的形成[12]，但并未研究AC与非整倍体的相关性，后续需扩大样本，对流产胚胎进行绒毛染色体检测，以进一步研究AC与非整倍体的相关性。

本研究中，无论是女方年龄<35岁患者还是年龄≥35岁患者，种植组RC均小于未种植组，但组间差异均不显著(P>0.05)。Desai等[13]认为RC不影响胚胎的整倍性。而Liu等[14]认为，RC导致发育潜能受损，种植力低下，并且胚胎发育前3 d RC可以反复发生。本文中，尽管RC不显著影响种植率，但是存在差异趋势，而笔者之前关于RC与囊胚形成的研究表明，对于D3细胞数≥6，且胚胎碎片≤20%的胚胎，RC显著影响囊胚及优质囊胚的形成[12]。

本研究中，无论是女方年龄<35岁患者还是年龄≥35岁患者，MN在两组间差异亦均不显著。而以往研究关于MN对胚胎种植结局的影响，结果不一。Aguilar等[15]发现，2细胞期多核不影响种植率，而4细胞期多核则与种植率低相关。有研究发现MN并不与染色体异常相关，但是当它与其他特殊分裂模式同时出现时，会降低胚胎的整倍体率[16-17]。本研究认为多核是否影响种植结局，与MN卵裂球发育最后所处的位置有关，是位于内细胞团还是位于滋养层细胞？另外，胚胎在膜融时也会排出部分异常卵裂球进行“自救”。尽管如此，本研究仍需对MN进一步深入研究，将多核发生的时间进一步细化、分类，或将多核与卵裂球不均等因素联合分析，是否也会发现MN对临床结局的影响同样值得探讨。

另外，如上所述，AC对女方年龄<35岁患者的种植结局有显著影响，那么如果AC联合其他异常分裂行为(MN、RC)结果会如何呢？本研究进行了进一步分析，发现MN、RC同AC联合出现时，并不能加大AC对种植结局的负作用。

结论

综上所述，对于女方年龄<35岁患者，选择s3时间较短且无特殊分裂模式AC的胚胎，可以改善胚胎种植结局，获得相对更好的临床结局；而对于女方年龄≥35岁患者，后续可扩大样本，进一步探讨s2对于胚胎种植结局预测的可行性。

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