表示，用SPSS统计软件进行方差分析，组间两两比较用q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。·实验研究·
过敏性慢反应物质白三烯(leukotriene；LTs)已被确认在支气管哮喘发病中起较重要的作用[1]。LTs受体在人体和大鼠体内有二种，一种为半胱氨酰白三烯(cysteine leukotriene；Cys-LTs)受体，另一种为白三烯B4(leukotriene B4；LTB4)受体。Cys-LTs受体在肺支气管平滑肌和巨噬细胞中有较强的表达，主要引起嗜酸细胞及淋巴细胞、单核细胞聚集并释放淋巴因子，在肺气管黏膜壁上大量聚集从而引起支气管平滑肌痉挛。LTB4在肺组织中也有较强的表达，可引起中性粒细胞的趋化并聚集，产生支气管黏膜壁的炎症反应，从而使支气管黏膜壁通透性增加，气道分泌物增多。也有文献报道称可能有第三种或更多的受体亚类。目前，阻断Cys-LTs受体的药物主要为孟鲁司特，而阻断LTB4受体的阻滞剂还在研究阶段。本实验利用大鼠哮喘模型，观察LTs受体表达后对肺脏的损害，以及阻滞LTs受体对肺部的影响。
1. 实验材料:健康大鼠30只，雌雄不限，体重180～250 g，由哈尔滨医科大学动物实验中心提供，卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)购自美国Sigma公司，孟鲁司特购自美国默沙东公司，雾化泵经由葛兰素公司提供。
2. 哮喘模型的建立：将30只大鼠分为空白对照组8只，哮喘模型组22只。参照近期报道的办法[2-4]，哮喘模型组在第0、7天，每只大鼠分别在腹腔内注射抗原混悬液(OVA1 mg、溶解于含10%氢氧化铝的无菌生理盐水0.5 ml配成混悬液)致敏。从第14天开始雾化1% OVA进行哮喘激发，每天1次，每次20 min。大鼠致敏激发后，即刻表现为呼吸急促，节律不规则，行动迟缓，严重者大小便失禁；连续激发表现为发音迟钝、竖毛、毛色失去光泽。在大鼠哮喘模型中挑选喘息症状最为明显者16只，再分成哮喘组和孟鲁司特组，每组各8只。其中孟鲁司特组在雾化第2天开始口服孟鲁司特(4毫克/日)。空白对照组均用无菌生理盐水代替。
3. 组织标本制备、留取支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavage fluid；BALF)：末次雾化激发后24 h麻醉大鼠，打开胸腔，暴露两肺，观察大体标本；然后经气管插管以无菌生理盐水3 ml进行全肺灌洗，重复3次后收集BALF作细胞学分类及淋巴细胞凋亡分析；以止血钳夹闭右支气管，切除右肺中叶用10%中性缓冲甲醛固定，留用组织病理学检查。
4. 组织病理切片制备：常规石蜡包埋切片，HE染色后，留取观察肺组织病理改变。
5. 细胞培养与白细胞计数：(1)将10×Binding buffer工作液加入无菌去离子水稀释成1×Binding buffer工作液。(2) 对于悬浮细胞，500～1 000 g离心5 min收集细胞。对于贴壁细胞，要用不含EDTA的胰酶消化细胞，加入细胞培养液。将细胞轻轻吹打下来，转移到离心管内，500～1 000 g离心5 min收集细胞。(3)收集细胞后，加入预冷PBS溶液后轻摇或移液器轻柔吹打洗涤，离心收集细胞，共洗涤两次。(4) 在细胞沉淀中加入1×Binding buffer工作液，重悬细胞，使细胞浓度达到1×106 cell/ml。(5) 吸取100 μl细胞悬液至一新管中，加入5 μl Annexin V-FITC和5～10 μl PI，轻轻混匀，室温避光孵育15 min。(6)流式细胞仪检测。染色孵育后，每管加入400 μl的 1×Binding buffer工作液，混匀后使用流式细胞仪检测(1 h内检测)。
6. 填加孟鲁司特后淋巴细胞凋亡率的对比观察：取对照组和哮喘组的细胞培养液各分成两个亚组，一亚组在细胞培养液加入孟鲁司特；另一亚组不加。37℃、5% CO2环境下培养20 h后进行淋巴细胞凋亡观察。
7. 统计学处理：BALF细胞分类及培养液淋巴细胞凋亡率，数据以表示，用SPSS统计软件进行方差分析，组间两两比较用q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
1. LTB4受体表达而Cys-LTs受体被阻断后对哮喘气道BALF细胞学的影响:哮喘组及孟鲁司特组，BALF中白细胞总数均明显高于对照组，其中哮喘组嗜酸粒细胞及淋巴细胞总数均明显高于孟鲁司特组。见表1。
2. LTB4受体表达，而Cys-LTs受体被阻滞后，对哮喘大鼠肺病理组织的影响:由图1可看出，对照组肺外观粉红，未见有异常充血表现；而另外两组，肺外观暗红，有充血、出血点表现。HE染色可见，哮喘组的肺病理切片显示，支气管黏膜下及肺泡间隔有大量炎症细胞浸润，以嗜酸粒细胞(EOS)、淋巴、单核细胞浸润为主，支气管上皮肿胀部分黏膜脱落，支气管平滑机增厚。孟鲁司特组EOS、淋巴、单核细胞浸润比哮喘组明显减少，但仍可见中性粒细胞大量浸润，支气管上皮肿胀，痰栓及大量分泌物，气道破坏肿胀改变。
3. 淋巴细胞凋亡的观察:将对照组、哮喘组，留取BALF细胞培养液，每组均分两份(即2个亚组)。一个亚组加孟鲁司特，另一亚组不加孟鲁司特。培养20 h后，观察淋巴细胞的凋亡情况。结果显示，加入孟鲁司特后，哮喘组淋巴细胞凋亡率增高明显 (P<0.01)，而对照组加药前后淋巴细胞凋亡率变化不明显。见表2。
早在二十世纪三十年代发现的过敏性慢反应物质，现已被确认为是一种重要的脂质前炎症介质。它是一种二十碳不饱和脂肪酸。由于其最初来源于白细胞，并且碳链中含有三个不饱和双键，故称为LTs。它在哮喘发作中起重要的作用，引起平滑肌痉挛，产生哮喘，是组胺的1 000倍。它主要分为两类，一类是具有强烈的化学趋化活性的LTB4，一类为Cys-LTs[5-6]。作用于受体后LTB4主要对中性粒细胞具有较强趋化功能，而Cys-LTs主要对嗜酸性粒细胞淋巴细胞有强趋化作用。目前，在支气管哮喘中，LTs的作用逐渐被认识，LTs受体阻断剂在临床的使用越来越广泛，其中Cys-LTs受体拮抗剂孟鲁司特在临床中广泛应用，并取得了肯定的效果[7-10]。Cys-LTs受体阻滞剂在预防支气管哮喘中，有以下几方面作用：(1)抑制炎症细胞的聚集和增殖，同时也诱导炎症细胞凋亡，作用于嗜酸性粒细胞、淋巴细胞等炎症细胞；(2)对细胞因子及炎症介质释放的影响，降低气道高反应性。另有报道，LTB4受体阻滞剂，可以抑制中性粒细胞聚集，降低毛细血管通透性和减少腺体黏液分泌，另外有抑制气道重塑，抗肺纤维化作用。但在临床中，孟鲁司特单以Cys-LTs受体拮抗剂为主，不能使中性粒细胞产生的炎症反应得以很好的控制，造成哮喘的恢复期时间长及炎症渗出消退的时间缓慢。目前LTB4受体阻滞剂还未应用到临床，其作用国内少有报道。
本实验结果显示，孟鲁司特组哮喘大鼠嗜酸粒细胞及淋巴细胞总数比哮喘组明显减少，而中性粒细胞总数无减少，这与Lee等[11-12]和Tenero等[13]研究报告相一致。与对照组相比，中性粒细胞总数确有显著的增加。从病理结果来看，孟鲁司特组淋巴细胞浸润明显比哮喘组细胞减少，但气道内渗出物，痰栓却无明显变化，气道黏膜仍有肿胀，破坏的表现。因此，单纯的应用孟鲁司特后气管炎症的损坏不能很快消除，中性粒细胞浸润，不能完好的得到控制，所以有气管痰栓、分泌物存留，甚至出现黏膜肿胀断裂。这与拮抗Cys-LTs受体后，LTB4受体继续表达有密切相关。哮喘组和对照组两组大鼠BALF淋巴细胞培养20 h观察淋巴细胞的凋亡情况，结果显示，加入孟鲁司特后，哮喘组淋巴细胞凋亡率增高明显 (P<0.01) ，而对照组是否加药淋巴细胞凋亡率无明显差别。提示孟鲁司特对BALF淋巴细胞的凋亡起促进作用[14-15]。从结果分析来看，Cys-LTs受体拮抗剂孟鲁司特对大鼠哮喘模型活化淋巴细胞产生有效的抑制，加快淋巴细胞的凋亡，降低了炎症反应，也会缩短气道高反应的持续时间。
表1 三组大鼠BALF中白细胞计数
组别鼠数白细胞总数(×109/L)细胞分类(×109/L)嗜酸粒细胞淋巴细胞中性粒细胞对照组哮喘组孟鲁司特组8886.05±0.7 12.7±1.2∗10.2±1.3∗0.27±0.05 1.20±0.08▲0.41±0.072.15±0.15 7.18±0.75▲3.36±0.353.05±0.252.85±0.555.34±0.15
注：与对照组比较，*P<0.05；与孟鲁司特组比较，▲P<0.05
表2 两组大鼠细胞BALF培养液加与不加孟鲁司特淋巴细胞凋亡率的比较
组别鼠数淋巴细胞凋亡率(%)不加孟鲁司特加入孟鲁司特哮喘组84.55±0.729.16±1.43∗对照组83.98±1.304.91±1.65
注：与对照组比较，*P<0.05
本实验显示Cys-LTs被阻断后，嗜酸粒细胞和淋巴细胞、浸润明显减少，提示Cys-LTs受体拮抗剂可以减少哮喘中重要介质的浸润，在哮喘中起到明显的控制作用。然而怎样迅速减轻气道炎症的破坏，哮喘发作后减轻气管炎症的刺激，迅速恢复炎症的改变，也是控制哮喘反复发作关键。LTB4受体拮抗剂是否会抑制中性粒细胞浸润，防止气管黏膜损坏，是将来研究的重要方向。Cys-LTs受体与LTB4受体拮抗剂的联合应用，效果可能会更好。这都有待于今后进一步的研究解决。
图1 哮喘大鼠肺病理组织HE染色
1 中华医学会分会呼吸学组.儿童支气管哮喘诊断与防治指南.中华儿科杂志,2016,54:167-181.
2 王雅娟,赵一婷,戴斌,等.两种大鼠哮喘模型的比较.中国药理学通报,2014,8:1175-1178.
3 杨飞,惠毅,闫曙光,等.卵蛋白加氢氧化铝致敏建立哮喘大鼠模型研究.现代中西医结合杂志,2018,27:1600-1602.
4 劳文艳,阮研硕,周艳丽,等.两种大鼠哮喘模型建立方法的比较.北京联合大学学报：自然科学版,2017,3:54-58.
5 Ying W,Wollam J,Ofrecio JM,et al.Adipose tissue B2 cells promote insulin resistance through leukotriene LTB4/LTB4R1 signaling.J Clin Invest,2017,127:1019-1030.
6 Tu ZL,Zhou ZY,Xu HC,et al.LTB4 and montelukast in transplantation-related bronchiolitis obliterans in rats.J Cardiothorac Surg,2017,12:43.
7 顾丽英,唐华,陈洁,等.不同治疗方案对学龄期中度持续性支气管哮喘患儿的临床疗效对比.浙江医学,2018,40:152-155.
8 刘美璇,张倩,黄建浩,等.白三烯受体拮抗剂(LTRA)对哮喘-慢阻肺重叠(ACO)患者气道炎症的影响及相关机制.复旦学报(医学版),2018,45:98-103.
9 王正军,纪建兵,苏宝凤,等.白三烯受体拮抗剂治疗儿童支气管哮喘合并变应性鼻炎的临床效果.系统医学,2018,3:125-127.
10 曾文射,王科峰,黄智聪.孟鲁司特钠治疗小儿喘息性支气管炎的疗效及对气道高反应性的预防效果.吉林医学,2019,40:102-104.
11 Lee E,Robetson T,Smith J,et al.Leukotriene receptor antagonists and synthesis inhibitors reverse survival in eosinophils of asthmatic individuals.Am J Respir Crit Care Med,2000,161:1881-1886.
12 Lee E,Lindo T,Jackson N,et al.Reversal of human neutrophil survival by leukotriene B(4) receptor blockade and 5-lipoxygenase and 5-lipoxygenase activating protein inhibitors.Am J Respir Crit Care Med 1999,160,2079-2085.
13 Tenero L,Piazza M,et al.Effect of montelukast on markers of airway remodeling in children with asthma.Allergy Asthma Proc,2016,37:77-83.
14 苗二梅.阿奇霉素联合孟鲁司特钠治疗小儿肺炎支原体肺炎的疗效及其对患儿T淋巴细胞亚群、免疫球蛋白及补体C3、C4的影响.中国实用医刊,2018,45:97-100.
15 施弦,郁峰.布地奈德联合孟鲁司特对支气管哮喘患儿炎性因子及免疫功能的影响.中国医药,2018,13:55-58.