PM2.5暴露对小鼠妊娠结局的影响及槲皮素干预作用研究

环境污染造成的不良妊娠结局包括宫内生长发育受限、迟缓、早产、低出生体重，不仅会增加儿童期患病/死亡的风险，也会增加成人期某些疾病如高血压、冠心病、糖尿病等的易感性[1]。孕期环境颗粒物暴露是引起不良妊娠结局的重要危险因素。人群流行病学研究发现孕期PM2.5(fine particulate matter, PM2.5)暴露与早产、新生儿低出生体重有关[2-3]；动物实验研究也表明：孕鼠PM2.5暴露，引起早产以及子代出生体重下降[4]。大量研究认为氧化应激与炎症反应是母体PM2.5暴露引起不良妊娠结局的重要分子机制[5-7]。槲皮素广泛存在于水果、蔬菜及一些中草药中，是人类饮食中最主要的生物类黄酮，具有明显的抗炎、抗氧化以及孕期安胎作用[8-10]。因此，槲皮素是否能够通过拮抗氧化应激与炎症反应来改善母体PM2.5暴露引起的不良妊娠结局，相关研究仍较为缺乏。此外，尽管当前有许多研究探索孕期PM2.5暴露对妊娠结局的影响，但是，几乎没有研究探索孕期PM2.5暴露引起的不良妊娠结局，是否也会在子代中出现。因此，本研究通过建立跨代遗传的动物模型，探索母体PM2.5暴露引起的不良妊娠结局是否会持续出现在子F2代中，同时探究槲皮素干预对母体PM2.5暴露引起的不良妊娠结局是否具有改善效应。

材料与方法

一、材料

1. 实验动物与分组：健康成年SPF级雌、雄性ICR小鼠，体重(30±2) g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供[SCXK(京)2015-0015]。动物饲养在屏障环境，温度(22±2)℃，相对湿度50%～60%，昼夜照明时间为12 h:12 h。实验动物给予普通饲料喂养，正常饮水。

2.PM2.5采集与制备：采用TH-150C型号智能中流量(TSP)采样器(天虹智能仪器表厂，武汉)进行PM2.5采集，采样时间为2016年9月15日—2016年11月14日，采样地点位于北京大学医学部公共卫生学院六层平台，采样高度为15 m (附近无高大建筑物阻挡)，采样流量设置为0.1 m3/min，颗粒物采集于石英滤膜上。用灭菌手术剪将载有颗粒物的石英滤膜剪成3 cm×4 cm大小，加入超纯水，水浴超声震荡20 min，加冰保持水温在20 °C以下，重复3次，收集洗脱液，并用6层灭菌纱布过滤。真空冷冻干燥后，用无菌PBS配制成不同浓度贮备液，-20℃避光保存。空白对照组的滴注液直接用干净的滤膜进行上述洗脱操作。

二、方法

1.实验操作：健康性成熟雌雄ICR小鼠按1∶1于黄昏时(18:00)合笼交配，第二天早上(7:00)检查阴栓，见阴栓即为受孕即为F0代孕鼠，当天定为妊娠第0天(GD0)，已确定怀孕的雌鼠单笼饲养，并喂繁殖期饲料，每天观察雌鼠有无嗜睡、烦躁、行动不便、阴道流血等异常情况出现。将孕鼠随机分为3组，空白对照组(12只)、PM2.5 (15 mg/kg) 染毒组(15只)、PM2.5+槲皮素干预组 (100 mg/kg)。实验期间动物自由饮水和进食。PM2.5染毒组、PM2.5+槲皮素干预组剂量的确定是根据本实验室前期研究结果确定[10]。

2. PM2.5染毒：各组F0代孕鼠分别于GD3、GD6、GD9、GD12、GD15上午，及产后5 d(LD5)、LD10、LD15在3%异氟烷短效气体麻醉下进行气管滴注：空白对照组给与1 mL/kg干净石英滤膜洗脱液滴注，PM2.5染毒组、PM2.5+槲皮素干预组按照1 mL/kg的体积滴注15 mg/kg PM2.5溶液

3. 灌胃：槲皮素(购自sigma公司，纯度≥95%)，以0.15%羧甲基纤维素钠为分散系。F0代母鼠在孕期、哺乳期每日灌胃。空白对照组、PM2.5染毒组给予0.1%的羧甲基纤维素钠水溶液灌胃，PM2.5+槲皮素干预组给与100mg/kg槲皮素灌胃。

4.跨代遗传的动物模型建立

F0代孕鼠分娩得到F1代小鼠母乳喂养，分娩后第3天，将每窝仔鼠按照性别分别称重并编号，根据仔鼠体重，利用随机数表法随机选择雌、雄仔鼠各3只，其余处死；于产后21 d离乳，雌雄分笼饲养。各实验组F1代在7～8周龄性成熟后进行组内交配传代：各实验组每窝仔鼠中随机选择1雌1雄进行1∶1交配合笼，得到F1代孕鼠；F1代孕鼠分娩后得到F2代，按照如上操作，各实验组F2代雌雄小鼠进行组内交配得到F3代。由此建立组内交配的跨代遗传模型。传代过程中避免同窝交配和近亲繁殖(如图1)。

5.实验动物相关指标监测：每隔6 d监测母鼠孕期体重变化和摄食量，计算食物利用率，母鼠孕期食物利用率(%) =母鼠孕期体重变化值(g) / 母鼠孕期摄食量(g)×100%；记录各实验组孕鼠分娩情况包括妊娠时间、产仔数、性别比、活产、死胎以及子代小鼠出生体重。

结果

一、F0～F2代孕鼠孕期体重、食物利用率

各实验组F0～F2代孕鼠孕期体重变化以及食物利用率如图2所示：各实验组F0～F2代孕鼠孕期体重及食物利用率的组间差异无统计学意义(P>0.05)。各实验组F0～F2代孕鼠妊娠时间、产仔数、性别比结果如表1、2、3所示：各实验组F0～F2代孕鼠妊娠时间、产仔数、性别比以及活产数、死胎数的组间差异无统计学意义(P>0.05)。

二、F1～F3代小鼠出生体重

各实验组F1～F3代小鼠出生体重如图3所示：与空白对照组相比，PM2.5染毒组F1～F2代小鼠出生体重下降，差异具有统计学意义(P=0.008, P=0.039)；按性别分组后，与空白对照组相比，PM2.5染毒组F1～F2代雄性仔鼠的出生体重下降(P<0.001, P=0.038)，而PM2.5染毒组F1～F2代雌性小鼠出生体重虽有所下降，但差异无统计学意义(P>0.05)；与空白对照相比，PM2.5染毒组F3代小鼠出生体重组间差异无统计学意义(P>0.05)。经槲皮素干预后，F1～F3代小鼠出生体重有所增加，但差异无统计学意义(P>0.05)。

F0-C:F0 pregnant mice in control group;F0-A:F0 pregnant mice in PM2.5 group; F0-H:F0 pregnant mice in PM2.5+qucertein intervention group.

F1-C:F1 offspring in control group;F1-A:F1 offspring in PM2.5 group; F1-H:F1 offspring in PM2.5+qucertein intervention group.

F2-C:F2 offspring in control group;F2-A:F2 offspring in PM2.5 group; F2-H:F2 offspring in PM2.5+qucertein intervention group.

讨论

在本研究中，通过建立小鼠跨代遗传模型，探究母体PM2.5暴露引起的不良妊娠结局是否会持续出现在F2代中以及槲皮素的干预作用。结果发现，母体PM2.5暴露引起F1～F2代小鼠出生体重下降，并且具有性别特异性，只在雄性小鼠中出现，本实验剂量下槲皮素干预可以在一定程度上改善母体PM2.5暴露引起的低出生体重，这种改善效应随着代际的传递而减弱。然而，母体PM2.5暴露对其他相关妊娠结局如母鼠孕期体重、妊娠时间、产仔数、性别比、活产数以及死胎数没有影响，也未发现槲皮素的改善效应。

孕期环境不良因素的刺激往往造成子代出生体重的异常。本研究发现母体PM2.5暴露引起F1代小鼠出生体重降低，按性别划分后，PM2.5染毒组F1代雄性仔鼠出生体重下降，而雌性仔鼠的出生体重无显著改变，这提示：母体PM2.5暴露引起F1代小鼠出生体重降低，并且这种效应存在性别特异性，雄性小鼠更加易感，这也与当前许多研究结论是一致的[2, 11-14] ；在组内交配的跨代遗传模型中，我们在F2代小鼠中发现了与F1代相同的低出生体重的异常表型，以及这种不良表型的性别特异性。直至F3代，不论是否按照性别分组，母体PM2.5暴露引起的低出生体重的表型不复存在。当前有研究认为，表观遗传修饰改变是环境因素诱导的不良妊娠结局的重要的分子机制之一[15]。Panasevich等对挪威面裂人群队列的研究发现，孕期吸烟或二手烟暴露的母亲，子代出生后，全基因组甲基化水平发生改变，其中有一部分基因与胎盘以及胚胎的生长发育相关[16]。而当与胎盘及胚胎的生长发育相关的基因表观遗传修饰的改变发生在生殖系细胞中时，母体PM2.5暴露引起的不良妊娠结局是可能在代际间进行传递的。然而，在本研究中，发现低出生体重的异常表型并没有持续出现在F3代，可能是因为，表观遗传修饰引起的异常表型在子代间传递的分子机制十分复杂，自然选择在该过程中也发挥重要的作用[17]，为保证机体更好的适应环境，有些异常表型会随着代际而逐渐消失[18]，即出现本研究中母体PM2.5暴露致子代低出生体重随着代际的传递而减弱的现象。

除了子代小鼠出生体重外，本研究并没有发现母体PM2.5暴露对其他妊娠结局指标如孕期体重、妊娠时间、产仔数、性别比、活产数和死胎数的影响。当前已有研究发现，PM2.5暴露引起体重增加，是肥胖发生的危险因素。然而，研究没有发现母体PM2.5暴露对孕期体重的影响，在跨代遗传的模型中，PM2.5染毒组F1～F2代孕鼠孕期体重也无显著变化。这与本课题组张敏佳的研究结果是相一致的，在其研究结果中发现，孕期PM2.5暴露对母体孕期体重以及孕期净增重均无显著的影响。而在Yi的研究中发现，大鼠孕期PM2.5暴露引起体重增长程度降低[19]。此外，人群流行病学研究发现，孕期环境PM2.5暴露会增加早产的风险[20-21]；动物实验结果表明，母体孕期PM2.5暴露缩短妊娠时间[22]、降低雄/雌性别比、增加死胎数等[23]，然而本研究并没有发现F0代孕鼠PM2.5暴露对妊娠时间、性别比、产仔数、死产、死胎数的影响。而PM2.5染毒组F1～F2代孕鼠以上妊娠结局指标也无明显改变。这些研究结论的差异可能与选择的研究对象、PM2.5染毒剂量、组成成分有关。这也提示，仍然需要更多的人群以及动物实验研究来进一步探究孕期PM2.5暴露对孕期体重、妊娠时间、产仔数、性别比、活产数和死胎数的影响。槲皮素通过母体吸收很容易通过胎盘，可能会直接(经胎盘传递)或间接(槲皮素对胎盘的影响)影响胚胎的生长发育。本研究发现，尽管差异没有统计学意义，孕期PM2.5暴露的F0代孕鼠给与100 mg/kg的槲皮素干预，能够改善F1代的出生体重，但这种改善效应随着代际的传递而减弱。已知孕期本身就是一个氧化应激、免疫应答水平增加的一个状态，而亲代环境颗粒物的暴露可能会加剧氧化应激造成的损伤。母体氧化损伤以及炎症水平增加，会引起胎盘发育异常，导致胎儿生长发育受限，出现低出生体重[21, 24]。而槲皮素具有极强的抗炎和抗氧化的作用，因此，可以认为，槲皮素改善子代小鼠第出生体重可能与其抗炎和抗氧化作用有关。本课题组前期研究结果发现，经槲皮素(100 mg/kg)干预后，母鼠血清中氧化应激产物以及炎症水平有所下降，胎鼠身长及体重增加[10]。而这种改善效应在代际间的减弱则可能是因为，槲皮素虽然可以改善氧化应激和炎症损伤，但是无法拮抗孕期PM2.5暴露引起的生长发育相关基因的表观遗传修饰的改变。

母体PM2.5暴露引起的子代低出生体重效应会传递至F2代，并随着代际减弱，而不会影响到F3代；并且这种效应具有性别特异性，只在雄性小鼠中出现；本实验剂量的槲皮素干预，可以在一定程度上改善子代的低出生体重，但这种改善作用也会随着代际的传递而逐渐减弱。

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