卵巢作为女性最核心的生殖器官，对维持生殖系统的正常运转以及内分泌的稳定具有重要意义。而女性的生殖衰老要远远早于身体其他器官的衰老。从35岁开始卵子迅速衰老凋亡，表现为卵子数目的急剧减少和卵子质量的急剧下降，到50岁左右生殖能力基本完全丧失。颗粒细胞作为与卵子直接接触的细胞，在卵子形成及成熟过程中发挥着重要作用。颗粒细胞是否也像卵子一样随着年龄增长而迅速衰老呢？本研究对此做了深入探讨。
对象与方法
一、对象
采集山西省妇幼保健院生殖医学中心2017年6月到2018年6月接受辅助生殖技术治疗周期中患者取卵过程中废弃的卵丘颗粒细胞。所选患者均为第一周期，年轻组(<35岁)，中年组(35～45岁)，老年组(>45)各50例，年轻组平均年龄(29.72±2.71)岁，中年组平均年龄(38.29±2.48)岁，老年组平均年龄(45.94±1.11)岁。
二、方法
1.检测内容：检测各组颗粒细胞衰老相关基因Sirt1表达，提取各组颗粒细胞RNA，利用Real-time PCR技术检测Sirt1相对表达量；检测各组颗粒细胞端粒相对长度，提取各组颗粒细胞DNA，利用T/S Ratio 方法检测端粒长度；检测各组颗粒细胞增殖能力，将颗粒细胞用透明质酸酶消化成单细胞，然后离心去除酶，用PBS洗两次，最后用培养液重悬，根据各自浓度计算加到培养皿中的细胞细胞悬液量，保证初始加入培养皿的细胞数均为1×106。放入培养箱中过夜，12 h后计数一次。培养36 h后再次计数。
2. 主要试剂及仪器：使用RNA提取试剂盒(QIAGEN)，Oligo dT(Takara)，dNTP Mix(Takara)，RNase Inhibitor (Invitrogen)，M-MLV Reverse Transcripstase(Invitrogen)，Syber green I Mix(Roche)。应用PCR仪(Eppendorf，Mastercycler gradient)和Real-time PCR仪(Bio-Rad，IQ5)。
3. 颗粒细胞收集方法：显微镜下从卵泡液中找到卵冠丘复合物，用巴斯德管机械分离卵母细胞及卵丘颗粒细胞，将卵丘颗粒细胞用PBS洗干净后-20℃冷冻保存用于基因表达及端粒长度检测。用透明质酸酶消化成单细胞，离心用PBS洗2次，然后在培养皿中培养，根据各自浓度计算加到培养皿中的细胞细胞悬液量，保证初始加入培养皿的细胞数均为1×106。12 h贴壁后计数，培养36 h后再次计数。
4. RNA提取及cDNA制备：各组颗粒细胞用试剂盒提取RNA，然后分别测浓度。反转录制备cDNA (dNTP(10mM)1μl，Oligo dT(500 μg/ml)1μl，RNA 2μg，dd H2O加至12 μl，离心混合均匀后， 65℃水浴5分钟然后立即冰浴2分钟。在冰上添加如下试剂：5X buffer 4 μl，0.1 M DTT 2 μl，RNA酶抑制剂(RRI)1 μl，反转录酶(MLV)1 μl，轻轻混匀后，按照如下程序反转：37℃ 60分钟，70℃ 15分钟，4℃保存，将反转所得的cDNA保存于-20℃冰箱。
5. Real-time PCR检测基因表达：将上述反转录得到的cDNA样品稀释10倍，按照下述体系加样：Syber green I Mix 10 μl，Primer F(4mM)1 μl，Primer R(4mM) 1μl，cDNA 1μl，ddH2O 7μl。反应程序如下：95℃ 10分钟，95℃ 15秒，60℃ 59秒，4℃保存，扩增得到的样品保存于-20℃。引物序列：SIRT1 F-TCAGTGTCATGGTTCCTTTGC，R- AATCTGCTCCTTT GCCACTCT。
6. T/S Ratio 检测端粒长度：提取各组颗粒细胞的DNA，测定各样品的基因组DNA的浓度，用灭菌水将浓度调至一致。端粒是多拷贝基因，所以利用Real-time PCR方法检测端粒与单拷贝基因DNA含量的比值就可以得到端粒的相对长度。引物序列：Telomere F- CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTT GGGTTTGGGTT，R-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTA CCCTTACCCTTACCCT。
7. 统计：数据采用统计软件SPSS 19.0 进行t检验和方差分析，以 P<0.05 为差异有统计学意义。
结 果
一、 颗粒细胞衰老相关基因Sirt1表达检测
利用Real-time PCR技术检测了年轻组(<35岁)、中年组(35～45岁)、老年组(>45岁)衰老相关基因Sirt1的表达情况(见图1)，年轻组(0.65±0.02)，中年组(0.69±0.03)，老年组(0.72±0.02)，统计结果发现中年组和老年组的Sirt1基因表达与年轻组相比，均无显著变化(P>0.05)。
二、 颗粒细胞端粒长度检测
提取颗粒细胞的DNA，利用T/S ratio方法检测3组颗粒细胞端粒的相对长度(图2)，年轻组(0.91±0.08)，中年组(0.87±0.06)，老年组(0.90±0.07)，统计结果发现3组颗粒细胞端粒长度并无明显差异(P>0.05)。
Y stands for young group(<35 years),M stands for middle age group(35-45 years), O stands for old group(>45 years)
图1 Real-time检测各组颗粒细胞Sirt1基因表达变化
Figure 1 The relative expression of SIRT1 gene ingranulosa cells detected by Real-time PCR, by age groups
Y stands for young group(<35 years),M stands for middle age group(35-45 years), O stands for old group(>45 years)
图2 T/S Ratio 检测各组颗粒细胞端粒长度变化
Figure 2 The telomere length ofgranulosa cells measured by T /S Ratio, by age groups
三、 颗粒细胞增殖能力检测
各组颗粒细胞在体外培养，12 h计数时细胞数并未明显增加，可能颗粒细胞刚贴壁，尚未开始分裂。36 h再次计数时，不同组的颗粒细胞都明显增殖。不同组分别取平均数，结果发现三组细胞数并无显著差异(P>0.05)。见表1。
表1 体外培养颗粒细胞计数结果
Table 1 Granulosa Cell counts after in vitro culture
Agegroups(years)NCellcounts(106)Cellcountsafter12h(106)Cellcountsafter36h(106)Y(<35)2011.201±0.1052.375±0.132M(35-50)1711.224±0.1132.107±0.089O(>50)1011.131±0.0982.224±0.114
Note:Y stands for young group(<35 years),M stands for middle age group(35-45 years), O stands for old group(>45 years)
讨 论
众所周知，女性35岁之后卵巢储备及卵子质量迅速下降[1-2]，导致生育力下降、后代染色体变异等发生概率增加[3-4]。随着年龄增长体内逐渐积累的氧自由基会对卵子产生氧化损伤，造成DNA损伤，由此而引发卵子的端粒长度变短，开启衰老信号通路，最终导致生殖衰老的发生[5-6]。
颗粒细胞是卵巢中的另一种重要细胞，它与卵子直接接触，对于卵泡形成及发育有重要作用[7-8]。它可以分泌激素，调控卵子发育成熟。而颗粒细胞是否也像卵子一样，在35岁到50岁之间迅速地衰老凋亡呢？Sirt1与衰老关系密切[9]，Sirt1与多种年龄相关性疾病的发生有关[10]。本实验结果发现颗粒细胞与卵子不同，随着年龄的增长衰老基因Sirt1的表达并无明显增长。这说明颗粒细胞并未像卵子一样很早开启衰老的信号通路。
端粒是由DNA重复序列(TTAGGG)以及几种结合蛋白组成的位于真核染色体末端特殊结构。它可以保护染色体末端以防止染色体之间的互相融合以及染色体丢失。在大多数的细胞中，端粒随着细胞的分裂而缩短。当端粒缩短到一定程度时，将失去对染色体的保护功能，并引发细胞周期停滞、细胞凋亡从而引起机体衰老[11]。有研究表明，由于不断受到环境氧化损伤，卵子随着年龄增长端粒呈缩短趋势，最终导致卵子基因组不稳定、染色体变异增加，甚至衰老凋亡[12]。然而我们的结果发现颗粒细胞端粒随着年龄的增长并无明显的缩短，也就从另一个侧面说明颗粒细胞不像卵子一样迅速衰老，而是保持了一个年轻状态。
年轻的细胞增殖能力较强，需要时可以迅速增殖补充机体需要。而衰老的细胞增殖能力下降，无法产生新的细胞供机体使用，从而导致器官及机体的衰竭。本实验检测了颗粒细胞在体外培养的增殖情况。结果表明颗粒细胞随着年龄的增长，仍然可以保持较强的增殖能力，也从另一角度说明了颗粒细胞仍保持着年轻状态。
卵子与颗粒细胞处于相似的微环境中，卵子迅速衰老而颗粒细胞可以保持年轻状态，其中机制仍值得进行深入探讨。可能颗粒细胞并不是之前认为的属于终末分化细胞，而是像干细胞一样具有一定自我更新的能力。已知成纤维细胞在转入四种多能性因子(Oct4, Sox2, Klf4 和c-Myc)后会被诱导成为多能性干细胞(IPS)[13]，而有研究者发现颗粒细胞只需转入两种多能性因子就可被诱导成为多能性干细胞[14]。这也从另一个角度说明颗粒细胞可能有部分干细胞特征，可以保持自身年轻状态。还有研究者在颗粒细胞中检测到了干细胞标记物Oct-4的表达[15-16]。
颗粒细胞虽然在卵泡中会随着卵泡闭锁而凋亡，但是最新研究发现卵泡中颗粒细胞的周期性凋亡是正常的生理过程，并不能作为卵巢衰老或卵子质量下降的标志[17]。本实验所取的颗粒细胞均来自正常发育卵泡的卵丘颗粒细胞，这部分颗粒细胞处在快速增殖，发挥功能阶段。随着年龄，这部分颗粒细胞保持年轻状态，发挥正常作用，并未见衰老迹象。
现代女性生育年龄普遍较晚，加上环境压力、生活习惯等问题，女性生殖健康问题形势日益严峻[18-19]，对辅助生殖的应用也是重大挑战[20]。女性在青春期时卵子储备仍有四五十万，如果这些卵子被保护起来，在需要时再移植入卵巢，由于颗粒细胞仍然年轻，是否还可以产生正常的卵子，使高龄女性重获生育力呢？颗粒细胞是如何抵御体内外环境压力，保持自身年轻状态，这些内在机制是否会对延缓卵子衰老提供一些启示呢？还有待更多的研究者对这些问题进行深入研究。
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