近些年有研究证实胎儿在母体内的生长发育受多种因素调控，包括遗传、激素调节、神经调节、生长因子调节、营养及环境等多重因素，但其调控的具体机制目前尚不完全清楚[1]。近年来，随着我国经济水平的快速发展和物质生活水平的提高，巨大儿的发生率也不断上升，由于巨大儿是难产的常见原因，对母婴均有不良影响，也已引起产科医生越来越多的重视。胎盘作为妊娠期母体与胎儿物质能量交换的中间站，在调节胎儿发育过程中发挥重要的作用。Klotho 蛋白是胎盘合体滋养细胞分泌的一种激素。有研究表明[2]，敲除 Klotho 基因的小鼠出现皮下脂肪减少、体重降低，提示Klotho 基因可能参与了小鼠体质量调节的某些关键环节。但是关于Klotho与新生儿出生体重的关系目前尚不明确。本文探讨了Klotho在妊娠期糖尿病孕妇胎盘中的表达及其与新生儿出生体重的关系，希望为巨大儿的治疗提供实验依据。
对象与方法
1. 研究对象：选取2014年12月—2017年4月本院产科的160例足月分娩孕妇为研究对象。年龄22～42岁，平均(27.8±8.5)岁，孕周37～40周，平均(38.8±11.3)周。入选标准：(1)自然受孕，单胎；(2)胎儿无染色体异常疾病高风险；(3)妊娠早期无先兆流产和感染等情况；(4)既往无高血压和心脏病等内、外科疾病史。排除标准：(1)随访资料不完整或失访者；(2)怀孕前肝脏疾病导致的肝功能障碍，肺炎、肝炎、结核等急慢性炎症性疾病；(3)免疫性疾病、高血压、肾脏疾病、恶性肿瘤等疾病；(4)多胎妊娠、非初次妊娠者；(5)新生儿合并畸形；(6)辅助生殖技术受孕。
2. 相关定义及分组：(1)GDM。排除孕前患有糖尿病者，在孕24～28周期间行75 g口服葡萄糖耐量试验，空腹及服糖后1、2 h的血糖值标准分别为5.1、10.0和8.5 mmol/L，任何一点血糖值达到或超过上述标准即诊断为GDM[3]。(2)出生体重分类。出生体重小于2 500 g为低体重；出生体重在大于等于2 500 g，小于4 000 g为正常出生体重；出生体重大于等于4 000 g为巨大儿。(3)研究对象分组。根据新生儿出生体重为正常还是巨大儿，以及产妇是否诊断为GDM，将研究对象分为GDM巨大儿组、GDM正常体重组和正常巨大儿组以及正常非巨大儿组(正常对照组)，各40例。所有入选对象均签字知情同意书，并取得医院伦理道德委员会批准。
3. 标本采集：胎盘娩出后，无菌状态下立即在胎盘母体面的中央取胎盘组织，大小约 1cm×1cm×1cm，去除钙化或者机化组织，每例患者取6管组织，置于液氮中暂存，-80℃冰箱保存，待蛋白提取。同时，另取新鲜胎盘组织，经10%甲醛固定，备用。
4. 免疫组化检测胎盘组织中Klotho的表达：收集的标本常规石蜡包埋，切片，SP法检测各组胎盘组织中Klotho的表达水平。一抗为兔抗人Klotho单克隆抗体(英国Abcam公司)，严格按照试剂盒说明书步骤操作。阳性表达的强度判定：Klotho蛋白阳性染色存在于细胞质中，呈现黄棕色颗粒状。阳性表达的强度判定：(1)随机取10个高倍视野，计算1 000个细胞中的阳性染色细胞，计算阳性率，0～5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，>50%为3分；(2)根据细胞染色程度标准评分，未着色、淡黄色、棕黄色和棕褐色分别为0分，1分，2分和3分。将(1)和(2)分数相乘的结果为综合评分，0～1分定义为阴性(-)，2～5分定义为弱阳性(+)，6～8分定义为中度阳性(++)，9分定义为强阳性(+++)。
5. Western Blot检测Klotho蛋白量表达：标本中加2 m1 RIPA组织裂解液，匀浆，冰浴30 min，4 ℃ 1 000 r/min离心3分钟，取上清，超声5 s×4次破碎细胞核，4 ℃ 12 000 rpm离心5 min，吸取上清10 μL用于测定蛋白质浓度。配制分离胶、浓缩胶，上样，电泳(电压为120 V)，转膜，转膜完毕后，切去膜多余的部分，切角标记方向，加封闭液1 h后加入兔抗人Klotho单克隆抗体(1∶1 000)(美国Santa Cruz公司)、HRP标记的第二抗体(1∶3 000)(美国Santa Cruz公司)进行免疫印迹检测。Bio-Rad成像仪曝光成像，Image Lab Software(Version 2.0.1，Bio-Rad)测定条带光密度。以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内参蛋白。
6. 统计学方法：本研究中所有数据分析均采用SPSS 22.0统计软件完成，孕妇的年龄、孕次、产次、孕周、新生儿出生体重、Klotho蛋白量等计量资料符合正态分布，均用
表示，组间比较使用t/F检验进行统计分析；孕妇Klotho蛋白量与新生儿出生体重的相关性采用Spearman 相关分析。P<0.05则认为差异有统计学意义。
结果
1. 新生儿及孕妇一般资料：160例新生儿，出生体重1 385～4 845 g，平均(3 286.4±451.1)g。男性78例，女性82例。胎龄37～40+6周，平均(38.7±5.6)周。孕妇的年龄、孕周、空腹血糖及分娩新生儿性别等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。
2. Klotho蛋白在各组胎盘组织中的表达：Klotho蛋白主要位于细胞质，在正常胎盘组织中表达呈阴性，GDM巨大儿组中 Klotho蛋白的阳性表达率高于GDM 正常体重组、正常巨大儿组及正常非巨大儿组，差异均有统计学意义(P均<0.05)；正常非巨大儿组、正常巨大儿组胎盘组织中 Klotho 蛋白的阳性表达率高于GDM正常体重组，差异均有统计学意义(P均<0.05)；正常巨大儿组中 Klotho蛋白的阳性表达率高于正常非巨大儿组，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表2、图1。
表1 各组孕妇一般资料及分娩新生儿性别比较
组别例数年龄( x±s,岁)孕周( x±s,周)空腹血糖( x±s,mmol/L)新生儿性别(男/女)GDM巨大儿组4027.1±6.039.1±4.74.7±0.321/19GDM正常体重组4026.8±7.138.3±1.14.7±0.419/21正常巨大儿组4026.9±5.838.9±0.24.5±0.218/22正常非巨大儿组4026.2±9.139.1±1.24.5±0.320/20
表2 Klotho蛋白在各组胎盘组织中阳性表达率比较
组别例数表达强度(例数)-+++阳性率+++(%)GDM巨大儿组4048101890.0正常巨大儿组∗#40101111875.0正常非巨大儿组∗#40111210772.5GDM正常体重组∗402254945.0
注：与GDM巨大儿组比较，*P<0.05；与GDM正常体重组比较，#P<0.05
3.各组胎盘组织中 Klotho 蛋白表达水平的比较
GDM巨大儿组胎盘组织中Klotho蛋白的表达水平(2.3±0.1)高于GDM 正常体重组(0.6±0.1)，差异有统计学意义(P<0.05)；正常巨大儿组胎盘组织中 Klotho 蛋白的表达水平(1.6±0.1)高于正常非巨大儿组(1.3±0.1)，差异有统计学意义(P<0.05)；无妊娠期糖尿病组Klotho蛋白表达水平低于妊娠期糖尿病组中Klotho表达水平，但差异无统计学意义(P>0.05)。见图2、图3。
4. 胎盘组织中 Klotho 蛋白表达水平与新生儿出生体重相关性分析
纳入全部研究对象数据进行Spearman相关分析，显示孕妇胎盘组织中 Klotho 蛋白表达水平与新生儿出生体重正相关(r=0.2，P<0.001)。
图1 Klotho蛋白在各组胎盘组织中的表达(SP染色，400×)
AKlotho蛋白在GDM正常体重组胎盘组织阴性表达；B Klotho蛋白在GDM巨大儿组胎盘组织强阳性表达；C Klotho蛋白在正常非巨大儿组胎盘组织中度阳性表达；D Klotho蛋白在正常巨大儿组胎盘组织弱阳性表达。
图2 各组胎盘组织中 Klotho 蛋白表达水平
A：GDM巨大儿组；B：正常巨大儿组；C：正常非巨大儿组； D：GDM正常体重组
图3 各组胎盘组织中 Klotho 蛋白表达水平
讨论
近年来，随着孕妇营养水平的提高、中国二胎政策的放开，新生儿出生体重、巨大儿的发生率也随着逐年增加。巨大儿对母体及新生儿健康都可以造成影响。分娩巨大儿的高危因素包括孕妇肥胖及糖尿病、过期妊娠、经产妇、巨大儿分娩史、高龄产妇及种族、民族等[4]。因此，研究巨大儿的相关因素，进一步了解巨大儿发生的相关机制，对降低围产期母儿并发症及改善预后具有重要意义。
Klotho 基因主要分布于肾脏、甲状旁腺、脉络丛及胎盘组织[5]。尽管Klotho蛋白分布较少，且在外周循环中水平低，但其在多种生物学功能中发挥作用，如能量代谢及钙磷代谢等[6]。有研究表明[2]，敲除Klotho 基因的小鼠出现皮下脂肪减少、体重降低，提示Klotho 基因可能参与了小鼠体质量调节的某些关键环节。大量研究表明[7-10]，Klotho 基因与糖尿病、高血压、肿瘤密切相关，那么，Klotho 基因是否参与了胎盘对于新生儿出生体质量的调节？胎盘中 Klotho 基因的表达水平与巨大儿的发生是否存在相关性？另外研究表明[11]，脐静脉血中的 Klotho蛋白水平远高于母亲及新生儿静脉血中Klotho蛋白水平，因此推测胎盘中Klotho 蛋白可能通过分泌到脐血中参与了胎儿的物质代谢，进而影响新生儿出生体质量。邵文佳等研究表明[12]，Klotho mRNA和蛋白在巨大儿胎盘组织中高表达，与新生儿出生体重密切相关。本研究结果表明，GDM巨大儿组胎盘组织中Klotho蛋白的表达水平高于GDM 正常体重组，正常巨大儿组胎盘组织中 Klotho 蛋白的表达水平高于正常非巨大儿组，相关性分析表明孕妇胎盘组织中 Klotho 蛋白表达水平与新生儿出生体重正相关，这些结果都提示Klotho与巨大儿的发生密切相关。Klotho基因调节新生儿出生体质量的具体机制可能是：(1)胎盘组织中的Klotho蛋白进入胎儿体内，促进脂肪细胞的分化，加速脂肪细胞的成熟，从而导致胎儿体重的增加，巨大儿的发生。(2)Klotho蛋白可以促进胎儿垂体分泌更多的生长激素，从而调节胎儿发育及新生儿出生体质量。(3)Klotho蛋白能增加细胞膜上钠钾泵数量，增加细胞膜内外的电位差，促进营养物质的转运，影响胎儿发育及新生儿出生体质量。
目前，氧化应激对巨大儿的影响的研究越来越多[13]。当抗氧化物质减少时就会导致氧化失衡，进而引起胎盘血管损伤，损伤血管内皮细胞，引起母婴各种不良结局。2型糖尿病的发病机制是胰岛素分泌不足和胰岛素抵抗，同时伴有氧化应激和细胞凋亡。有研究发现[14]，Klotho 蛋白能阻止胰岛素受体的酪氨酸磷酸化，干扰胰岛素的细胞内信号传导，引起胰岛素抵抗。另外动物实验表明[15]，敲除Klotho基因的小鼠血糖和胰岛素水平明显降低，胰岛素抵抗增加。但另外临床研究结果表明2型糖尿病患者血浆中Klotho蛋白水平与正常人群水平差别不大，提示Klotho基因与糖尿病关系不密切[16]。本研究结果表明，无妊娠期糖尿病组Klotho蛋白表达水平低于妊娠期糖尿病组中Klotho表达水平，但无统计学意义，但本次研究样本量小，未分析母体糖化血红蛋白、糖化白蛋白、胰岛素水平与胎盘组织中Klotho含量的关系，有待进一步大样本研究。
本次研究对象都是在同一家医院纳入，可能影响结果的代表性，今后需要进行更大样本量的前瞻性队列研究。另外Klotho基因的生理机制和调节目前仍未阐明，胎盘组织Klotho基因能否作为预测疾病的严重程度与预测新生儿出生体重的实验室指标，有待于进一步研究。
综上所述，GDM巨大儿患者胎盘组织中Klotho蛋白表达水平显著增高，Klotho蛋白表达水平与GDM巨大儿的发生显著相关。胎盘组织Klotho蛋白水平与新生儿的出生体重相关，Klotho蛋白还可能与巨大儿的发生相关。从分子水平了解到巨大胎儿的发生机制对于更早期预防由巨大胎儿发生可能造成的影响等问题有重要的意义和发展前景。
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