复发性流产(recurrent spontaneous abortion，RSA) 是指与同一性伴侣连续发生3次或3次以上的自然流产，大多数为早期流产，少数为晚期流产，发病率约1%～5%[1]，严重者可导致不孕不育[2]。复发性流产的原因包括胚胎染色体异常、免疫功能异常、内分泌功能异常、子宫解剖异常等[3]。越来越多的研究表明不明原因的自然流产与免疫因素相关[4-5]。胚胎作为同种异体移植物不被母体免疫排斥是免疫学原理的例外；而妊娠的成功与否，取决于母体与胚胎或胎儿之间的免疫调节[6]。Thl型细胞分泌肿瘤坏死因子-α(TNF-α) 等，可以促进机体的细胞免疫应答，也参与了自身免疫疾病发病过程[7]。在妊娠过程中，Th1细胞影响胚胎着床及发育，Th1型细胞因子占优势会引起妊娠丢失[8]。Th2型细胞则分泌白介素-10 (IL-10)等，可以促进机体的体液免疫应答，另一方面也参与自身免疫疾病的发病过程，Th2型细胞因子占优势有利于母胎免疫耐受的产生和妊娠的维持。细胞因子维持胎儿和母体免疫系统之间的平衡，一旦这种动态平衡被打破，母体内的免疫系统对胚胎或胎儿的排斥反应由原来的抑制转变为增强，就会引起病理性妊娠，严重者则会发生RSA[9]。本课题通过测定RSA组和对照组中绒毛及蜕膜组织中肿瘤坏死因子α诱导蛋白-2(TIPE2)、TNF-α、IL-10的表达变化，旨在研究复发性流产患者中TIPE2通过对Th1/Th2细胞因子平衡的影响，参与RSA的发生与发展。
对象与方法
1. 研究对象：选取2017年9月—2018年8月山西省妇幼保健院妇科收治的RSA患者30例(RSA组)，选择同期就诊要求终止妊娠的正常早孕患者、既往无不良孕史、本次妊娠无先兆流产征兆33例(对照组)。两组患者均无染色体异常、生殖道异常；近3个月内没有自身免疫疾病、内分泌疾病、生殖器感染和激素治疗，两组患者均以人工流产术终止妊娠。两组研究对象年龄22～35岁，孕龄6～12周。在年龄及终止妊娠孕周数上差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。本研究通过山西省妇幼保健院医学伦理委员会批准，标本的收集均经本人及家属知情同意并签字。
表1 RSA组和对照组孕妇基本资料的比较
组别例数年龄(岁)终止妊娠天数(d)RSA组3030.4±4.8∗60.3±8.1∗对照组3328.0±5.458.1±8.0
注：与对照组比较，*P>0.05
2. 试剂和仪器：TIPE2购自武汉三鹰公司；TNF-α、IL-10均购自北京博奥森公司；二抗试剂盒、DAB显色均购自博士德公司；粘附载玻片购自世泰公司。
3.样本收集和处理：收集人工流产后绒毛和蜕膜组织，生理盐水洗涤样本，至无明显肉眼可见残留血液，立即置10%的中性甲醛溶液中固定，乙醇脱水，常规石蜡包埋，连续切片。
4.检测方法：采用免疫组织化学SP法检测两组患者绒毛和蜕膜组织中的TNF-α、TIPE2、IL-10表达。用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)代替一抗作阴性对照，按试剂盒说明书操作。由两位病理科医师据盲法阅片。结果判定标准：镜下阳性细胞包质呈棕黄色，高倍镜下可见棕黄色颗粒。随机观察5张100倍视野，并且所有图片均在同一光学条件下拍摄，采用显色强度与阳性细胞百分率法相结合判读结果。按染色强度及阳性细胞所占百分比计分：细胞无色为0分、淡黄色为1分、棕黄色为2分、棕褐色为3分；阳性细胞百分比<5%为0分、5%～25%为1分、26%～50%为2分、>50%为3分；上述两分值相乘，乘积等于0判为阴性、1～3为弱阳性(+) 、4～5为中度阳性(++) 、≥6为强阳性(+++) ，+ 、++ 、+++均为阳性。
5.统计学方法：采用SPSS23.0统计软件。计数资料比较用χ2检验，相关性分析用Spearman相关分析法，P<0.05为差异有统计学意义。
结果
1.RSA组和对照组绒毛中IL-10、TNF-α、TIPE2表达的比较:RSA组绒毛中IL-10、TIPE2阳性例数低于对照组，TNF-α阳性例数高于对照组，P<0.05，差异有统计学意义。见表2。
2. RSA组和对照组蜕膜中IL-10、TNF-α、TIPE2表达的比较：RSA组蜕膜中IL-10、TIPE2的阳性例数低于对照组，TNF-α的阳性例数高于对照组，P<0.05，差异有统计学意义。见表3。
3. RSA组绒毛及蜕膜组织中IL-10、TNF-α、TIPE2阳性表达相关性分析：Spearman相关分析显示RSA组中IL-10、TNF-α和TIPE2在绒膜和蜕膜的表达呈正相关，且有统计学意义P<0.05，见表4。
讨论
正常胚胎不被母体排斥依赖于母-胎界面的免疫耐受,一旦这种免疫耐受被打破,将导致RSA[10]。正常情况下Th1/Th2型免疫反应维持在平衡状态，但是这种平衡是一种负反馈的动态平衡[11-13]。在胚胎植入时及以后的妊娠过程中，母-胎界面的细胞因子以Th2型为主，使Th1型细胞因子介导激活NK细胞和细胞毒性T淋巴的应答抑制，防止对滋养细胞和胎儿的继发损伤，使妊娠得以成功进行。Th1型细胞因子对着床、滋养细胞生长、胚胎发育和胎儿生存是有害的；当Th1/Th2型免疫反应平衡偏向Th1时，则可能影响胚胎及胎儿的生长发育，严重时可导致免疫型流产[14-15]。李昭荣等[16]的研究表明，RSA患者蜕膜组织中Th1型细胞因子的表达水平均高于正常妊娠组，而Th2型细胞因子的水平却显著低于正常妊娠组，吕兴钰等[17]的研究结果提示，RSA患者绒毛与蜕膜中TNF-α的水平显著高于对照组，而IL-10的表达水平显著低于对照组。本研究结果显示：RSA组绒毛及蜕膜组织中TNF-α明显高于对照组、IL-10明显低于对照组，这与以往报道一致。
TIPE2是2002年发现的一免疫负调控分子，在炎症和维持免疫稳态方面具有负调节作用。TIPE2参与了较多疾病的发生与发展，Zhang L[18]等报道了TIPE2蛋白在结肠、阑尾、腺上皮细胞、食管、宫颈分层鳞状上皮细胞等多种细胞中的高度表达。TIPE2在儿童哮喘[19]和慢性乙肝病人中外周血的表达量是降低的，TIPE2在感染引起的胞吞作用和氧化应激中均发挥重要的抑制作用，同时还参与了慢性阻塞性肺疾病[20]、慢加急性肝衰竭[21]、溃疡性结肠炎[22]等疾病过程，因此TIPE2的免疫负调控功能已被大家广泛认同。但是，TIPE2在复发性流产中的机制国内外文献少有报道。本研究结果显示RSA患者绒毛及蜕膜组织中TIPE2、IL-10的表达均低于对照组，TNF-α表达高于对照组，IL-10、TNF-α、TIPE2在RSA组绒毛及蜕膜组织中的表达均呈正相关，提示IL-10、TNF-α、TIPE2复发性流产患者绒毛及蜕膜组织中均发生了改变。
表2 RSA组和对照组绒毛中IL-10、TNF-α、TIPE2表达的比较
分组 例数IL-10阳性例数阳性率(%)TNF-α阳性例数阳性率(%)TIPE2阳性例数阳性率(%)RSA30826.7∗1963.3∗723.3∗对照组332060.61030.31957.6
注：和对照组比较，*P<0.05
表3 RSA组和对照组蜕膜中IL-10、TNF-α、TIPE2表达的比较
分组例数IL-10阳性例数阳性率(%)TNF-α阳性例数阳性率(%)TIPE2阳性例数阳性率(%)RSA组30516.7∗1860.0∗930.0∗对照组331957.6824.22163.6
注：和对照组比较，*P<0.05
表4 RSA组绒毛及蜕膜组织中IL-10、TNF-α、TIPE2阳性表达相关性分析
指标绒毛蜕膜r值IL-10850.742∗TNF-α19180.932∗TIPE2790.843∗
注：*P<0.05
总之，母体与胎儿间的协调共存是妊娠成功的关键[23-24]。本实验研究结果表明母胎界面免疫的失衡与RSA发生密切相关，随着生殖免疫学的发展，RSA的发病机制将得到进一步阐明，为病理妊娠的预防和治疗，改善母儿预后必将有突破性进展。
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