卵巢肿瘤是妇科癌症病人死亡的主要原因之一，其中以浆液性肿瘤最为常见。由于卵巢位于盆腔深部，故通常发病较隐匿，加上缺乏普查、诊断、治疗的有效措施，且早期检测策略缺乏特异性和敏感性，导致75%的患者发现时已是晚期致命的阶段。因此，对其机制的研究及检测卵巢肿瘤的可靠生物标志物的设计和发现一直是妇科肿瘤医师研究的热点。只有对其发生机制有较深刻的理解，才能更好地指导临床治疗[1-3]。有研究者认为，Wnt/β-catenin 信号通路与卵巢上皮性癌关系密切[4]。本研究主要应用免疫组化法(SP法)检测Wnt/β-catenin 信号通路成分GSK-3β、c-myc在卵巢浆液性肿瘤中的表达情况，探讨Wnt/β-catenin 信号通路在卵巢浆液性肿瘤发病的作用机制，为卵巢癌的发生、发展、预后及治疗提供依据。
材料与方法
1.材料：收集哈尔滨医科大学附属第一医院2016年09月—2018年11月110例病理科保存的人卵巢组织标本蜡块(包括正常卵巢上皮组织26例、良性浆液性囊腺瘤24例及浆液性癌60例)。所有标本经两位病理医师重新复检，再次确认病理组织学分型及分级。本研究在取样本前充分告知患者标本用途，并取得患者同意，且经哈尔滨医科大学附属第一医院伦理委员会批准。
2. 方法：采用免疫组化法(SP法)。所有标本4μm厚连续切片，二甲苯脱蜡，柠檬酸盐修复抗原，加入一抗(兔抗人GSK-3β单克隆抗体，工作浓度1∶50；鼠抗人c-myc单克隆抗体，工作浓度为1∶50，购自北京博奥森生物技术有限公司)，4℃过夜，PBS冲洗3次，加入二抗(多聚物酶标二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司)，20 min后PBS冲洗3次，二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木精衬染，脱水、透明、封固，显微镜观察并摄片。
3. 结果判定：GSK-3β在细胞质呈棕黄色颗粒为阳性染色，c-myc在胞核呈棕黄色颗粒为阳性染色，每张切片至少随机观察10个高倍视野(×400)，每个视野计数100个细胞，判断标准如下:
(1)根据染色细胞数占细胞总数的比例评分。染色细胞数0%～5%为0分，染色细胞数在6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分；
(2)根据染色细胞的染色强度评分。未见出现棕黄色或棕色颗粒为0分，(弱)淡黄色为1分，(中)棕黄色为2分，(强)棕褐色为3分；
(3)前两者乘积0～2分为(-)，3～5 分为(+)，6～8分为(++)，≥9 分为(+++)。
综合评分结果：≥3分作为阳性判断标准。
4.统计学方法：采用SPSS 22.0软件进行统计学处理，采用χ2检验进行表达差异分析，采用Spearman等级相关检验进行相关性分析，以P<0.05表示差异有统计学意义。
结果
1.GSK-3β在卵巢浆液性肿瘤中的表达：GSK-3β在细胞质呈棕黄色颗粒为阳性染色(见图1),在正常卵巢组织、良性浆液性囊腺瘤及浆液性腺癌中的表达阳性率逐渐增高，分别为26.9%、66.7%及71.7%,差异有统计学意义(P<0.05，见表1)；GSK-3β在卵巢浆液性癌组织的高级别组、淋巴结转移组、FIGO分期III+IV期的表达阳性率明显高于低级别组、无淋巴转移组、I+II期(P均<0.05，见表2)。
2.c-myc在卵巢浆液性肿瘤中的表达：c-myc在胞核呈棕黄色颗粒为阳性染色(见图2)，在卵巢浆液性腺癌中的表达阳性率明显高于卵巢正常组织及良性浆液性囊腺瘤,表达差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。c-myc在卵巢浆液性癌高级别组(81.0%)的表达高于低级别组(22.2%)，提示其与卵巢浆液性癌的病理分级有关(P<0.05见表2)，III+IV期卵巢浆液性癌组织中c-myc的表达(65.5%)高于I+II期(61.3%)，但差异无统计学意义(P>0.05，见表2)，提示c-myc的表达与FIGO分期无关；c-myc在有无淋巴结转移组中的表达无明显差异。
表1 GSK-3β、c-myc在卵巢正常组织、良性浆液性囊腺瘤和浆液性癌三组中的表达
组织类型例数GSK-3β阳性阳性率(%)∗c-myc阳性阳性率(%)∗正常组织26726.9623.1良性浆液性囊腺瘤241666.7833.3浆液性癌604371.73863.3
注：*P<0.05
表2 GSK-3β、c-myc在卵巢浆液性癌组织中与临床参数的比较
临床参数例数GSK-3β阳性阳性率(%)c-myc阳性阳性率(%)浆液性癌分级∗#604371.73863.3 高级别423583.33481.0 低级别18844.4422.2淋巴结转移∗# 有363391.72261.1 无241041.71666.7FIGO分期∗# I+II期311858.11961.3 III+IV期292586.21965.5
注：GSK-3β在两组的表达比较，*P<0.05； c-myc在两组的表达比较，#P<0.05
3. 卵巢浆液性癌中GSK-3β与c-myc表达的相关性：卵巢浆液性癌中GSK-3β的阳性率为71.7%(43/60)，c-myc的阳性率为63.3%(38/60)，共同的阳性率为56.7%(34/60)，共同的阴性率为21.7%(13/60)。相关性分析显示，两者在卵巢癌中的表达呈现出正相关，差异有统计学意义(P<0.05)。
讨论
Wnt/β-catenin信号通路也称作经典Wnt信号通路，是高等动物胚胎组织发育分化所必需的关键信号通路，主要参与细胞的增殖、分化、极化、凋亡与抗凋亡等，是涉及癌症侵袭转移过程的信号通路，Wnt/β-catenin信号通路已发现在很多癌症中都有激活，包括卵巢癌[5]。
GSK-3β是一种高度保守丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是糖原合成酶激酶的限速酶。有研究表明[6]，GSK-3β过度表达或异常激酶活性可以增加细胞增殖和活力，促进细胞恶性转化，导致肿瘤发生。当各种致癌因素导致经典Wnt通路中的相关靶基因异常表达时，Wnt信号通路被异常激活，Wnt信号通过与特异性膜受体FZD结合传导信号，GSK-3β的活性异常，使β-catenin降解过程受阻而在胞浆内大量积聚，达到一定水平时就可以转入核内通过与TCF/LEF相互作用促进下游靶基因(c-myc、cyclinD1、MMP-7等)转录，使原癌基因或细胞调控因子基因转录活性增强，导致细胞性质变化、细胞周期失控，诱导细胞恶性增殖，最终引起肿瘤的产生和进展。β-catenin 在细胞核中也可以直接与GSK-3β结合，降低β-catenin/TCF依赖的基因转录，促进卵巢肿瘤细胞增殖。除β-catenin 外，GSK-3β还可以调节Axin的稳定性和APC连接β-catenin 的效率，引发细胞周期的失控，从而促进肿瘤细胞的增殖、侵袭。 Georgievska[7]等报道称GSK-3β抑制剂可能通过调节细胞周期蛋白抑制细胞增殖。有研究[8-11]表明，GSK-3β的“过度激活”可能作用于几种人类癌症中的癌基因，包括结肠癌，口腔癌，骨肉瘤，恶性黑色素瘤等。GSK-3β抑制剂已被证明可抑制胰腺癌、前列腺癌、结肠癌、白血病中恶性细胞的增殖。本实验结果表明：GSK-3β在癌组织的表达明显高于正常组织及腺瘤组织，在癌组织中的比较发现，在高级别、淋巴结有转移及FIGO分期高的病例中GSK-3β高表达。因此，GSK-3β可以作为一个理论点进行深入研究，以提高临床对卵巢浆液性肿瘤的认识。
原癌基因c-myc是 Wnt/β-catenin 信号通路中非常重要的靶基因,是细胞周期调控因子中的一员，多种肿瘤中c-myc 高表达与β-catenin 异常表达和Wnt突变有关[12]。c-myc由β-catenin/TCF-4激活转录，可促进细胞分裂增殖，也可激活细胞周期蛋白，在细胞从G0期→G1期的过程中起重要作用，进而引起细胞性质的变化，刺激胚胎发育，促进细胞生长，从而导致细胞的恶性增殖。同时，c-myc基因也具有转化细胞的能力，可以协同Her-2基因激活细胞增殖信号，促进恶性肿瘤的生长。c-myc还可通过改变细胞骨架动力学，细胞粘附，侵袭性和血管生成能力来调节细胞外信号传导和支持细胞增殖的能力，导致肿瘤的发生。本研究结果显示，c-myc在卵巢浆液性癌中高表达，与Ning[13]等研究结果一致。高级别组c-myc的表达率明显高于低级别组，差异有统计学意义，提示c-myc的表达与卵巢浆液性肿瘤病理分级有关；III-IV期卵巢浆液性癌组织中c-myc的表达高于I-II期，差异无统计学意义，提示c-myc的表达与FIGO分期无关。c-myc在有淋巴结转移和无淋巴结转移组织中也无明显差异。因此，c-myc在促进卵巢细胞增殖及恶性转化的过程中，可能与细胞分化有关，但可能不参与卵巢癌的肿瘤进展和转移。
GSK-3β与c-myc表达之间存在正相关，且均在卵巢癌中高表达，表明GSK-3β和c-myc可能在卵巢癌发生发展过程中起着一定的协同作用，且二者对肿瘤的发展均存在正调节作用，二者的高表达均能够持续Wnt信号通路，从而激活一系列靶基因引起细胞的持续增殖及恶性进展，但两者之间是否存在协同调节作用需进一步实验研究证实。
综上所述，Wnt信号通路本身是一个复杂的基因网络，Wnt信号通路的异常激活可引起细胞异常增殖、分化而导致肿瘤。本研究证实，GSK-3β、c-myc在卵巢浆液性肿瘤的发生发展过程中起着重要作用，因此，GSK-3β、c-myc有望成为卵巢浆液性肿瘤早期诊断、早期治疗的分子标志物。通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的某些关键因子或应用Wnt拮抗剂可阻断信号通路的异常激活，从而抑制肿瘤的发生，有望成为卵巢浆液性肿瘤的治疗新靶点。但具体的作用机制及靶点间的相互作用还需要进一步研究。
图1 GSK-3β在卵巢正常组织(A)、良性浆液性囊腺瘤(B)、浆液性癌(C)中的表达(SP,×200)
图2 c-myc在卵巢正常组织(A)、良性浆液性囊腺瘤(B)、浆液性癌(C)中的表达(SP,×200)
1 吴秋英,吴小霞.Gsk-3β在卵巢浆液性肿瘤中的表达及意义.齐齐哈尔医学院学报,2015,10:1425-1426.
2 Yeganeh PN,Richardson C,Bahrani-Mostafavi Z,et al.Dysregulation of AKT3 along with a small panel of mRNAs stratifies high-grade serous ovarian cancer from both normal epithelia and benign tumor tissues.Genes Cancer,2017,8:784-798.
3 Nguyen L,Cardenas-Goicoechea SJ,Gordon P,et al.Biomarkers for early detection of ovarian cancer.Womens Health,2013,9:171-187.
4 Gatcliffe T A,Monk B J,Planutis K,et al.Wnt signaling in ovarian tumorigenesis.Int.J.Gynecol.Cancer,2010,18:954-962.
5 Dai YQ,Guan Q,Liu Q,et al.Expression of β-catenin and c-myc of the Wnt signaling pathway in ovarian serous adenocarcinoma and the roles in prognosis.Chinese Journal of Clinical Experimental Pathology,2014,7:81026-81048.
6 Chen S,Sun KX,Feng MX,et al.Role of glycogen synthase kinase-3β inhibitor AZD1080 in ovarian cancer.Drug Des Devel Ther,2016,10:1225-1232.
7 Georgievska B,Sandin J,Doherty J,et al.AZD1080,a novel GSK3 inhibitor,rescues synaptic plasticity deficits in rodent brain and exhibits peripheral target engagement in humans.J Neurochem,2013,125:446-456.
8 Li T,Lai Q,Wang S,et al.MicroRNA-224 sustains Wnt/β-catenin signaling and promotes aggressive phenotype of colorectal cancer.J Exp Clin Cancer Res,2016,35:1-11.
9 Liu Y,Duan LJ,Wan SF,et al.Evaluation of Wnt signaling pathway activity and tumor malignant biological behavior in ovarian cancer.Journal of Hainan Medical University,2015，21:724-727.
10 李康,旦增.Wnt/β-catenin信号与胃癌防治研究进展.南方医科大学学报,2014,12:1852-1856.
11 Enzo MV,Rastrelli M,Rossi CR,et al.The Wnt/β-catenin pathway in human fibrotic-like diseases and its eligibility as a therapeutic target.Mol Cell Ther,2015,3:1-13.
12 张世蘋,张旭.Wnt信号通路在肿瘤调控方面的研究进展.中国药理学通报,2017,33:14-18.
13 Ning YX,Luo X,Xu M,et al.Let-7d increases ovarian cancer cell sensitivity to a genistein analog by targeting c-Myc.Oncotarget,2017,8:74836-74845.