闭经是妇科常见的症状，可因生殖器发育不全、下丘脑-垂体功能异常、药物、遗传等不同的原因引起，通常将闭经分为原发性闭经和继发性闭经。原发性闭经是指女性年龄超过14周岁仍无第二性征发育，或者年龄超过16周岁出现第二性征发育但无月经来潮[1]。导致原发性闭经的原因很多，其中染色体异常是引起原发性闭经的重要遗传因素，且不能治愈，因此若能早发现早诊断，并通过合理的治疗改善患者的性器官发育，对减少患者身心伤害及提高生活质量具有明显的帮助[2-3]。本文对122例原发性闭经患者进行外周血染色体核型分析，并且对涉及Y染色体的患者利用PCR荧光探针法进行Y染色体微缺失检测，以探讨原发性闭经与染色体异常及Y染色体微缺失的关系。
对象与方法
1. 研究对象：选择2015年1月至2017年12月于江西省妇幼保健院就诊的122例原发性闭经者，社会性别为女性，平均年龄14～31岁。每位患者详细记录病史，抽取外周血。
2.纳入标准：原发性闭经的诊断标准为：年龄超过14岁，第二性征未发育；或者年龄超过16岁，第二性征已发育但月经还未来潮。因化学因素、放射因素、免疫因素或医源性损伤等引起的闭经患者均排除在外。纳入的患者均签署知情同意书。
3.研究方法
(1)外周血染色体核型分析：抽取患者外周血2 ml，使用肝素抗凝。用7号针头接种28滴(约1 mL)全血于淋巴细胞培养液中(达辉生物技术公司)，37℃，5%二氧化碳培养箱中进行培养72 h。培养终止前4 h加入秋水仙素(20 μg/mL)，按常规方法制片，G显带，分辨率为320～400条带。使用莱卡染色体核型扫描分析系统，计数30个核型，至少分析5个核型，嵌合体病例计数至少50个核型。按照人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN2013)的标准命名核型。
(2) 全血基因组DNA提取：严格按照试剂盒说明操作，静脉抽取患者2 mL的EDTA抗凝外周血，混匀后取200 μL全血，采用自动化仪器(天隆NP968磁珠核酸提取仪)抽提DNA。
(3)PCR扩增及荧光信号定量分析：采用两管多重PCR扩增，四个通道(FCMVIC/ROX/Cy5)荧光检测的方法，判断AZFa (sY84,sY86)，AZFb (sY127,sY134)，AZFc (sY254,sY255) 三个区域六个序列标签位点(STS)的微缺失，同时设置两个内对照基因：男性性别决定基因(SRY)和编码锌指蛋白基因ZFX/ZFY。
结果
1.外周血染色体核型及临床表现
122例原发性闭经患者中共检出异常核型30例，异常率为24.6%。其中性染色体数目异常10例，性染色体结构异常10例，性染色体数目及结构异常1例，性染色体与常染色体平衡易位1例，性分化异常6例，常染色体异常2例。30例异常核型中涉及性染色体的有28例，占93.3%(表1)。性染色体核型的异常，常导致其生长发育异常，且不同的性染色体异常核型，其临床表现也有差异之分，主要表现为特纳综合征、超雌综合症、生殖发育异常等(表2)。
2.Y染色体微缺失检测
对6例涉及Y染色体的患者进一步检测Y染色体微缺失，发现4例46,XY患者及1例45,X[22]/46,X,dic(Y)[28]嵌合体患者存在SRY基因；1例核型为46,X,+mar[76]/45,X[20]/46,XY[4]的患者有SRY基因，但是Y染色体存在AZFc区域缺失。
讨论
闭经是妇科常见的症状之一，根据病因的不同可分为原发性闭经和继发性闭经。染色体异常是原发性闭经重要因素之一，其异常率可达23%～45%[4-6]。在本研究的122例原发性闭经患者中，共检查30例染色体异常，异常率为24.6%，与国内其他文献报道接近。在30例染色体异常患者中，性染色体异常有28例，占93.3%，提示性染色体异常是导致原发性闭经的重要原因之一[3]。其中包括性染色体数目异常10例，性染色体结构异常10例，性染色体数目及结构异常1例，性染色体与常染色体平衡易位1例及性分化异常6例。
性染色体数目异常中45,X是最常见的核型，有5例，占16.7%，这也是先天性卵巢发育不全(Turner综合征)常见的异常核型[7]。由于缺乏一条X染色体，患者表现为智力一般、身材矮小、蹼颈、肘关节外翻、幼稚型生殖器。此外，3例45,X/46,XX嵌合体患者则根据嵌合比例的不同表现出轻重不一的症状。2例47,XXX(超雌综合症)患者，表现为身材矮小、肥胖、短颈、骨骼发育异常[8]。
性染色体结构异常主要包括X染色体长臂等臂、长臂缺失、短臂缺失、假双着丝粒等，占33.3%。不平衡的染色体结构异常通常会造成卵巢发育不全，导致闭经[9]。本研究中10例患者主要表现为智力稍差、乳房未发育、无阴毛、外阴幼女型、幼稚子宫、卵巢发育不良、未见卵泡。另外还有1例性染色体-常染色体平衡易位，可能由于平衡易位造成基因结构或功能的破坏而致卵巢发育不良，引起闭经。
表1 30例异常染色体核型分析
分类 染色体核型例数构成比(%)性染色体数目异常45,X516.745,X/46,XX310.047,XXX26.7性染色体结构异常46,X,del(X)(p11p22.3)13.346,X,del(X)(q26)13.346,X,del(X)(q21.2)26.746,X,idic(X)(p11.2)13.346,X,i(X)(q10)26.746,X,psudic(X)(p11.2)13.346,X,inv(X)(q13q26)13.346,XX/46,X,add(X)(p22.1)13.3性染色体数目和结构异常45,X/46,X,i(X)(q10)13.3性染色体与常染色体平衡易位46,XX,t(X;4)(p22.1;q12)13.3性分化异常46,XY413.345,X/46,X,dic(Y)13.346,X,+mar/45,X/46,XY13.3常染色体异常46,XX,inv(2)(p21q32)13.346,XX,inv(9)(p11q13)13.3
表2 部分染色体异常核型患者的临床表现
核型 临床表现45,X特纳综合症表型明显,表现为智力一般、身材矮小、蹼颈、肘关节外翻、幼稚型生殖器45,X/46,XX嵌合型特纳综合征体征较轻,智力稍差47,XXX超雌综合症,身材矮小、肥胖、短颈、骨骼发育异常46,X,del(X)智力稍差、乳房未发育、无阴毛45,X/46,X,i(X)(q10)外阴幼女型、幼稚子宫、卵巢发育不良、未见乱泡46,XY无子宫卵巢、性腺条索状
Y染色体的95%是男性特异性的区域，包含性别特异性的胚胎发育的遗传物质，如睾丸决定基因(sex determining region Y,SRY)以及控制精子发生的基因无精症因子(azoospermia factor,AZF)。AZF基因影响着精子的生成，发生AZF基因的缺失称为AZF微缺失，也称Y染色体微缺失[10-11]。本组4例核型为46,XY的患者生物学性别为男性，称为性反转综合症，儿童期临床表现为两性畸形、性腺发育不良、身材矮小，成人表现为闭经以及不孕症。对这4例性反转患者和1例45,X[22]/46,X,dic(Y)[28]嵌合体患者进行AZF基因检测，发现SRY均为阳性。而核型为46,X,+mar[76]/45,X[20]/46,XY[4]的患者虽有SRY基因，但是Y染色体存在AZFc区域缺失，临床表现为无子宫卵巢、性腺条索状。
本研究中，除去30例检测染色体异常的患者，仍有92例患者为正常核型46,XX，但由于其卵巢衰竭或性腺功能障碍，在临床上表现为原发性闭经。虽然这部分患者为正常核型，但鉴于目前染色体核型分析技术分辨率有限，尚无法有效检出小于5Mb的结构异常和变异，存在染色体微小缺失的漏检[12]。此外，国外有研究者利用基因组杂交技术对染色体核型正常但卵巢早衰的患者进行检测，发现部分患者存在染色体微缺失[13]。由此可见，对于染色体核型正常的原发性闭经患者，进一步的基因检测以排除染色体微缺失的可能性是十分有必要的。
综上所述，引起原发性闭经的重要原因之一为性染色体异常，对闭经的患者尤其是伴有性腺、生殖器异常的患者进行核型分析，对患者早诊断早治疗有很好的临床意义。
1 谢幸,苟文丽.妇产科学.第8版.北京:人民卫生出版社,2013,352-355.
2 Practice Committee of American Society for Reproductive Medicine.Current evaluation of amenorrhea.Fertil Steril,2008,90:S219-225.
3 田秦杰.原发性闭经的病因.实用妇产科杂志,2014,30:321-323.
4 王晓迪,王笑盈.124例原发性闭经患者的细胞遗传学分析.中国优生与遗传杂志,2018,26:49-50.
5 夏蓓,郑杰梅,刘之英,等.530例原发性闭经患者的细胞遗传学分析.中华医学遗传学杂志,2017,34:302-303.
6 余小艳,黄颖浩,宋婕萍,等.287例闭经患者的细胞遗传学分析.中国生育健康杂志,2009,20:50-51.
7 Saikia UK,Sarma D,Yadav Y.Delayed Presentation of turner syndrome:challenge to optimal management.J Hum Reprod Sci,2017,10:297-301.
8 吴小花.48,XXXX超雌染色体一例.中国生育健康杂志,2018,29:189+202.
9 Razavi Z,Momtaz HE.Balanced Reciprocal Translocation t(X; 1) in a Girl with Tall Stature and Primary Amenorrhea.Iran J Med Sci,2017,42:210-214.
10 Birowo P,Putra DE,Dewi M,et al.Y-Chromosomal Microdeletion in Idiopathic Azoospermic and Severe Oligozoospermic Indonesian Men.Acta Med Indones,2017,49:17-23.
11 Ak
nsal EC,Baydilli N,Dündar M,et al.The frequencies of Y chromosome microdeletions in infertile males.Turk J Urol,2017,44:389-392.
12 Kim JW,Lyu SW,Sung SR,et al.Molecular analysis of miscarriage products using multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA):alternative to conventional karyotype analysis.Arch Gynecol Obstet,2015,291:347-354.
13 Liao C,Fu F,Yang X,et al.Analysis of Chinese women with primary ovarian insufficiency by high resolution array-comparative genomic hybridization.Chin Med J (Engl),2011,124:1739-1742.