·综述·
子宫宫腔表面的内膜呈现激素依赖性、规律性改变，具有高度再生能力，在育龄女性体内随月经周期不断生长、分化、蜕膜化和脱落[1]。为系统地了解内膜生理及病理学特征，学者们以干细胞(stem cells，SCs)为切入点进行了大量的实验研究。至今，部分学者已从多种实验动物子宫内膜中分离出几种可能的干/祖细胞，其中包括近年发现的内膜侧群细胞(endometrial side population cells，ESPCs)[2]，并对其在内膜中的分布、生长条件、来源、多向分化潜能以及对内膜的重建作用等进行了详细探究。本文就ESPCs的生物学特性及功能、相关研究进展和亟待解决的问题进行综述。
子宫的宫腔表面被覆子宫内膜，是一种激素依赖性、规律性再生的组织，随月经周期不断地生长、分化、蜕膜化和脱落，就未经妊娠的育龄期女性而言，会历经约480次的周期性变化，并且这种现象也可出现于用雌激素治疗的绝经女性[1]。内膜包括功能层和基底层，功能层又可细分为致密层和海绵层，功能层在月经期可全部或部分脱落，基底层较薄且存在于整个月经周期，在月经周期的第5～6天，增生期的内膜腺体和间质开始从基底层再生，从而形成一个厚度为5～7 mm新的功能层[3]。根据子宫内膜高度再生的特性，有学者提出人类子宫内膜可能存在SCs，从而使得内膜得以周期性更新[4]。2004年，Chan等人从内膜分离出子宫内膜干细胞(endometrial stem cells，ENSCs)。然而，这些细胞的解剖学部位和生物学功能尚未完全明确，ENSCs在体内外分化为子宫内膜细胞的作用机制尚不清楚[5]。尽管ENSCs亚群研究较多，但是关于内膜中何种细胞种群可行使干/祖细胞功能目前尚无达到共识。鉴于对多种动物(人类、灵长类、啮齿类、猪、牛、绵羊、山羊，母马)的实验探索，Lara等提出ENSCs可能包括以下几种类型干细胞：内膜间充质干细胞(endometrium mesenchymal stem cell，eMSCs)、上皮干细胞、ESPCs、子宫内膜再生细胞等[3]。
1.侧群细胞的发现：1996年，Goodwell等人在用流式细胞分选术(fluorescene-activated cell sorting，FACS)对Hoechst33342染色的小鼠骨髓细胞进行分离鉴定，发现了在造血SCs中有小部分细胞只含有极少量荧光，将其命名为侧群细胞[6]。随后，Matsuzaki证实骨髓中的侧群细胞(side population cells，SPCs)能够长期重建致死剂量辐射小鼠的造血系统[7]。除啮齿类动物外，还分别从人类、恒河猴及犬类的骨髓SCs中成功分离SPCs[8-11]。从2001年起，Zhou等对SPCs染料低着色原因进行了探索，发现一种SPCs表面的质膜转运体：ABC家族转运蛋白G2(ATP-binding cassette transporter G2/breast cancer resistance protein1,ABCG2/BCRP1)，可在分子泵的作用下将胞内的荧光染料通过主动运输排出胞外[12-13]。尽管Hoechst染料也可在非紫外波长的光照下显色，如蓝光(450/50 nm滤波器)和红光(675/20 nm滤波器)[14]，但是紫外光照下分辨效果最佳[15]。大量研究人员已从多种哺乳动物的多个组织器官中成功分离SPCs，包括骨髓、大脑、角膜、视网膜、乳腺、肝脏、肾脏、睾丸、皮肤、骨骼肌、心脏、肺脏、子宫等[16-18]，并且于正常和肿瘤组织均有发现[8]。
2. ABC家族转运蛋白：对Hoechst染料作用的ABC家族属于转运蛋白超家族，主要包括以下几种：ATP结合盒转运体B1、ATP结合盒转运体C5和ABCG2(BRCP1)[14]。维拉帕米[13]和利血平[19]可抑制其活性。此类蛋白与ATP结合，可转运多种内源性及外源性化合物，如叶酸、胆固醇、卟啉等，发挥促进细胞自主调节、铁代谢等作用[14]，同时，因癌性SPCs表面的ABCG2可快速清除细胞质中的化疗药物，考虑认为其与癌症对化疗药物的耐药性相关[20]。但是Challen 等人的研究表明：ABCG2并非SPCs的表面标记物，仅仅为此类细胞活动的标志[21]。
1.侧群细胞在子宫的分布、含量及影响因素：2004年，Chan等从人体子宫内膜细胞中分离出ESPCs[5]，因腺体和间质形成是从基底层再生而来，推测ESPCs可能主要位于基底层。然而，Cervello[16]等人对ABCG2进行免疫组化染色观察，发现功能层和基底层的结果均呈阳性，考虑可能是ESPCs由基底层迁移至功能层发挥作用所致。2007年，Ono及同事以啮齿类动物子宫肌层为原料，成功提取SPCs[22]。但是，因内膜和肌层之间表面缺少中间组织，并且内膜和肌层接触面均呈锯齿状，故基底层常侵及肌层[1,17]，据此，不排除侵入肌层的内膜组织含有包括ESPCs在内的子宫内膜干/祖细胞的可能性。
Miyazaki在提取ESPCs时，发现该类细胞在所有子宫内膜细胞中占(3.13%±0.61%)[19]。其后，Kato在对人体内膜分选的间质细胞进行研究时，报道月经期ESPCs比例显著高于增生期和分泌期[4]。2008年，Tsuji等人对人类内膜细胞计数，发现增生期ESPCs数量明显高于分泌期[23]。而在Masuda团队的研究中，他们将人类内膜组织按发育阶段分为4类：增生早期(包括月经期)、增生晚期、分泌早期和分泌晚期，表明增生早期ESPCs比例最高，到分泌晚期降至最低[24]。不容忽视的是，Cervello[16]研究发现ESPCs在上皮和间质部分的比例分别为0.06%～6.20%和0.01%～3.80%，并且证实了这个比例在女性整个生育年限以及用性激素治疗的绝经妇女体内保持稳定。
Hyodo等人注射脂多糖制作BALB/c小鼠内膜受损模型时，发现模型小鼠的ESPCs数量增加，而且这种情况只有在单独进行雌二醇宫腔植入时发生，若单独使用黄体酮或二者联合作用均不能观察到这种变化[25]。近年，有学者证实向免疫缺陷小鼠制作的子宫平滑肌瘤模型体内同时注射雌二醇及黄体酮，可通过旁分泌途径激活Wnt/β-连环蛋白信号通路，作用于瘤体，致使包括SPCs在内的细胞数量的增加[26]。
2.子宫内膜侧群细胞来源：多数ABCG2+细胞表达CD31，优先定位于毛细血管，而非大血管[27]。同样，eMSCs样细胞分布在血管网周围[16]。因此，ABCG2+细胞与eMSCs样细胞分布位置的相似性，表明作为一种至今尚未认证的ENSCs，ESPCs可能和eMSCs高度相关，推测ESPCs可能最初起源于骨髓[27]。之后的研究也证实骨髓来源的细胞可迁移至小鼠和人类子宫内膜，促进组织中的血管再生[16]。总的来说，上述研究结论均支持ESPCs最初来源于骨髓的观点，可以解释ABCGs+细胞弥漫分布于子宫内膜的现象。但是，也有研究显示接受男性骨髓移植的女性子宫内膜中的ESPCs不包含异性来源的细胞[16]，该结论与上述观点相悖。因此，仍需对ESPCs的来源进行深入研究。
3.子宫内膜侧群细胞特性：因为Hoechst染色时间的长短和温度的高低对分离细胞效果均有影响[28]，Kato[4]在提取ESPCs时以不同条件筛选细胞，结果表明50 μM Hoechst、染色90 min所得ESPCs数量最多；同时发现该类细胞可分裂生成子代小圆细胞，大部分表型为CD9-及CD13-[5]。Cervello[16]用胶原酶消化增生期内膜后，利用免疫磁珠法(magnetic cell sorting，MACS)依次分离了上皮和间质部分表面同时布标到CD9及CD13的细胞，其占比高于FACS所得数据，考虑可能与Hoechst染色后10%左右的活性细胞死亡有关，但FACS分离所得的纯度更高。
有研究表明，c-kit在ESPCs和非ESPCs(non-endometrium side population cells，NESPCs)中同时表达。除此之外，70%上皮部分ESPCs以及80%间质部分ESPCs表现为CD90+，CD34+仅占1%～2%，CD45+占5%～7%，CD105+占4%，这些数据提示两类组织中的ESPCs均具有间叶表型[5]，说明ESPCs具有间叶组织来源特性。另外，子宫内膜中仅15%～17%的SP细胞可在蛋白水平检测出BCRP1；该研究同时说明ESPCs具有端粒酶活性，且相较于内膜多能和单能SCs而言，端粒长度处于中等水平[16]。
雌激素受体(estrogen receptor，ER)ɑ和β在ESPCs和NSPCs中差异表达，实验结果表明ESPCs表达ERβ+；NSPCs表达ERɑ以及孕激素受体(progesterone receptor，PR)[17]，提示雌激素可通过直接对ESPCs或者通过对其生态位作用从而影响ESPCs的性质，间接解释雌激素作用对ESPCs数量产生的影响。
4.子宫内膜侧群细胞的生长条件：2004年，Chan等人发现低氧条件下上皮部分和间质部分ESPCs的克隆效率分别是常氧条件下的6.5和3.1倍[5]。在低氧环境中，间质部分ESPCs克隆形成率相对于NESPCs显著增高；上皮部分二者差别不大[16]。
Kato团队在实验过程中，将上皮和间质部分的ESPCs和NESPCs均分别置于两种条件中进行培养：(1)含有 IL-6、促血小板生成素(thrombopoietin，TPO)、干细胞因子(stem cell factor,SCF)和10% FCS的细胞培养基(dulbecco′s modified eagle medium，DMEM)胶原涂层培养皿，(2)为主动脉-性腺-中肾区(aorta-gonad-mesonephros，AGM)间质细胞来源的饲养层细胞。结果发现两种培养体系中的SPCs均增殖缓慢，且100 μg/mL 丝裂霉素C可抑制细胞的分裂增殖[4]。该学者将MACS分离所得表面同时不表达CD9及CD13的细胞同时胞置于第一种培养基进行体外增殖，发现此类细胞生长也较为缓慢[4]，但NESPCs的增殖能力要强于ESPCs[23-24]。事实上，将ESPCs与NESPCs联合培养可提高其克隆效率，说明NESPCs可能为ESPCs生长增殖提供了所必须的微环境[19]。
有研究显示经过长达9个月的追踪观察后，发现针对上皮部分的ESPCs而言，饲养层细胞中的细胞在3个月左右可形成细胞群落，此后每代的细胞群落直径相似；上皮和间质部分的NESPCs在培养过程中形态逐渐扁平，最终在3个月内衰亡[4]，这充分显示了ESPCs的长期增殖能力。
5.子宫内膜侧群细胞的多向分化潜能：有研究在体外成功诱导CD9+和CD13+的ESPCs分化过程中发现CD9和CD13的表达量有所降低，且与培养时间长短无关，同时能将该类细胞诱导分化为成纤维样细胞(CD13+)[4,17]。Tsuji在体外培养时添加雌二醇和黄体酮，发现ESPCs可出现类似于分泌期间质细胞的形态和功能变化，同时发生蜕膜样变[23]。也有研究发现ESPCs可分化形成中胚层谱系细胞，如血管内皮细胞、脂肪细胞和成骨细胞[17]。这些结论均说明ESPCs细胞具有多向分化潜能，可能是子宫内膜上皮和间质的干/祖细胞。
此外，通过异体移植研究发现ESPCs在体内亦具有促进组织再生能力。2010年，Masuda等人将ESPCs植入免疫缺陷小鼠(NOG小鼠)的肾包膜后，可以使小鼠体内包含腺体结构的内膜样组织再生。然而，只有8%的ESPCs异体移植的小鼠重建了结构完好的内膜腺体样组织[24]，说明ESPCs重建需要一个由其它内膜细胞成分提供适合其生长的微环境。
基于上述研究，Miyazaki等人用慢病毒介导TdTom(tdTmomato)荧光感染人体内膜ESPCs或者NESPCs，分别将两种细胞移植至NOG小鼠肾包膜，发现二者均可促进内膜样组织再生，但是ESPCs的重建率≤10%，这与之前的研究结果一致。随后，又将TdTom+ESPCs与分散的内膜细胞混合，向小鼠肾包膜植入混合物，结果发现内膜组织重建率100%，并且TdTom+ESPCs主要存在于重建组织中，研究结果说明内膜细胞可促进ESPCs对子宫内膜的重建作用[19]，与Masuda[24]等人认为内膜细胞可能为ESPCs生长提供适合的微环境结论一致。进一步对移植部位生成的囊性肿物进行HE染色，结果显示肿物内具有轮廓清晰的腺b体和间质，Vim抗体检测结果阳性，表明肿物由ESPCs形成。而且，将TdTom+ESPCs和内膜细胞混合物植入小鼠体内后，部分腺体主要由TdTom+细胞组成，但是其余腺体由TdTom+细胞和TdTom-细胞同时组成，表明ESPCs和混合的内膜细胞均参与了腺体的再生[19]。但已有研究证实人类子宫内膜的每一个腺体都是单克隆源性的，故可推测内膜细胞中未经标记的ESPCs和TdTom+ESPCs可能随机参与腺体形成，因此导致了“杂交的”或者“镶嵌的”腺体形成[29]，故单一腺体是否为单克隆源性有待进一步研究。
对TdTom标记的ESPCs和NESPCs进行波形蛋白(vimentin，Vim，间质标志物)、角蛋白(cytokeratin，CK，上皮标志物)、 ɑ-平滑肌肌动蛋白(ɑ-smooth muscle actin，ɑ-SMA，平滑肌标志物)、CD10、CD326、CD31的检测。结果表明，CD326+(上皮标志物)和CD10+(间质标志物)细胞比例在ESPCs和NESPCs所形成内膜组织中并无明显不同。相较于NESPCs，Vim+、CK+和CD31+细胞在ESPCs在重建的内膜组织中含量更丰富，间接说明了ESPCs可进行多向分化，对子宫内膜重建的作用更明显，结果分析发现ESPCs主要参与了上皮组织的重建，推测ESPCs可能含有更高比例的干/祖细胞，可以分化形成不同的内膜成分。但ɑ-SMA+ESPCs和NESPCs数量无差异[19]。ESPCs对于内皮细胞形成的作用要大于NESPCs，然而，CD31+和CD34+细胞，并不一定是已经分化良好的内皮细胞，也可能是内皮祖细胞[30]。W5C5+细胞在二者中无差异，表面同时表达CD140b和CD146的细胞在ESPCs重建组织含量较高[19]。总的来说，ESPCs和NESPCs相似的表面标记物阳性的细胞、内皮细胞和eMSCs在ESPCs中相较于NESPCs更为丰富。
Kato开展的体外研究发现上皮部分来源的ESPCs也可形成腺体样结构，但间质部分ESPCs只能形成少数短轴结构的细胞群，并非腺体样结构[4]。说明ESPCs在体内外均可形成腺体样结构。
尽管已对可能的多个种群干细胞进行了大量研究，但是关于内膜中何种细胞亚群可行使干/祖细胞功能目前尚未达成共识，包括ESPCs在内的ENSCs的解剖学部位、生物学特性及功能尚未完全明确。也还没有证据表明ESPCs可以在单细胞水平形成不同种祖细胞来源的干细胞[1]。由此可知，ESPCs的生物学特性和多向分化潜能在单细胞水平还需要进一步探讨。但是，人类子宫内膜的动态性变化致使在研究时需要根据月经周期将组织分期进行检测，目前内膜细胞的分离方法也使得各部分ESPCs分选较为困难，间质部分可掺入不同比例的上皮细胞，反之亦然；并且，采用FACS分选ESPCs，需要做长期的细胞准备工作，过程较为繁琐，且Hoechst染料染色时间的长短、环境温度对FACS分选结果均有影响。因此，必须在已有分选方式的基础上，不断探索新方法分离纯化细胞。
保持子宫内膜正常的生理结构是女性生殖的基础，损伤后的修复功能就显得至关重要，因此发展包括ESPCs在内的SCs疗法，将其应用于宫腔粘连和薄型子宫内膜的治疗具有重要的意义。
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