子宫颈癌是一种常见女性恶性肿瘤，其发病率仅次于乳腺癌，并呈年轻化趋势。近20年来，由于巴氏法涂片发明与临床应用，全球子宫颈癌的发病率已快速下降，自Foley等[1]报道宫颈细胞涂片可作为宫颈癌筛查工具引入国家筛查方案以来，子宫颈癌整体发病率下降了3.5%。由于宫颈细胞涂片的准确性受主观因素影响，主要取决于细胞病理医师的经验及水平，其敏感度差异较大，敏感度由40%至80%，最低可达到20%。据最新的数据统计，中国每年仍有6万2千例的子宫颈癌新发病例，死亡病例约为3万例[2-3]，子宫颈癌给女性的生殖健康造成了威胁。近年来，发现全基因组DNA甲基化检测新方法，可用于恶性肿瘤检测。研究证实，DNA甲基化程度随肿瘤发展而累积，如PAX1、SOX1、ZNF582甲基化程度与CIN病变发展进程具一致性，随着病变级别的增加，甲基化程度也增高[4-5]。本研究主要通过检测ASCUS人群宫颈脱落细胞的PAX1与ZNF582基因甲基化水平及高危型人乳头瘤病毒感染状况，并与阴道镜检查与病理切片进行比对，评价检测PAX1和ZNF582基因甲基化在宫颈癌筛查特别是ASCUS分流中的效果，为ASCUS诊治提供可靠理论依据，降低妇女对ASCUS恐慌，减少过度治疗，减少女性子宫颈癌发病和死亡的风险，具有社会意义和临床应用价值。
对象与方法
1.对象：选取 2017 年 7 月—2018 年 12 月在本院妇科门诊行宫颈癌筛查且细胞学涂片结果为ASC(ASCUS & ASC-H)的患者265例，年龄25～65岁。
2.方法：采用重亚硫酸氢盐转化和定量甲基化特异性PCR(QMSP)测定 ASC患者宫颈脱落细胞中PAX1和ZNF582基因甲基化的水平，采用第二代杂交捕获检测技术进行高危型HPV检测，以宫颈活检病理结果作为病人分层的金标准，根据受试者工作特征曲线下面积(AUC)，探索PAX1与ZNF582甲基化阳性结果的cutoff 值。根据病理活检组织的检测结果，分析HR-HPV、PAX1、ZNF582基因甲基化的灵敏度(SE)、特异度(SP)、阳性预测值(PPT)、阴性预测值(NPT)、阳性似然比(和阴性似然比(-LR)。效果间比较采用卡方检验。采用ROC曲线分析HR-HPVDNA检测及甲基化检测识别ASC患者中CIN Ⅱ+、CIN Ⅲ+的能力。ROC曲线可反映检测方法的敏感性和特异性，ROC曲线下面积越大，诊断效能越高，其诊断准确性越大。AUC值在0到1之间，AUC<0.5，提示诊断效能较差；AUC>0.5，提示有一定的诊断能力；AUC越接近于1，提示诊断的准确性越高。
SE=TP/(TP+FN)×100%；SP=TN/(TN+FP)×100%；PPT=TP/(TP+FP)×100%；
NPT=TN/(TN+FN)×100%；+LR=SE/(1-SP)；-LR=(1-SE)/SP
(注：TP=真阳性，FP=假阳性，TN=真阴性，FN=假阴性)
3.cutoff值探索：当PAX1的ΔCP值小于8.8时或ZNF582的ΔCP值小于11.1 时，ASC患者患癌风险增加。这与预设的甲基化阳性标准(PAX1的cutoff 值为9，ZNF582的cutoff值为11)基本相符。
4.统计学处理：分析软件应用 MedCalcV 15.2和SPSS 21.0，检验水准α=0.05，P<0.05表示差异具有统计学意义。
结果
1.ASC患者活检病理结果：265 例 ASC 患者中，ASCUS 患者 203 例，其中病理学结果为宫颈浸润癌 4 例(2.0%)、CIN Ⅲ(包括原位癌)18 例(8.9%)、CIN Ⅱ 30 例(14.8%)、CIN Ⅰ 65 例(32.0%)、炎症者 86 例(42.4%)，见表1。其中病理结果为 CIN Ⅱ+(包括CIN Ⅱ、CIN Ⅲ及宫颈浸润癌)的患者为 52 例(25.6%,52/203)，病理结果为 CIN Ⅲ+(CIN Ⅲ及宫颈浸润癌)的患者为 22 例(10.8%,22/203)。
265例 ASC 患 者中，ASC-H 患者 62 例，其中病理诊断为宫颈浸润癌 8 例(12.9%)、CIN Ⅲ(包括原位癌)18 例(29.0%)、CIN Ⅱ 4 例(6.5%)、CIN Ⅰ 2 例(3.2%)、炎症者 30 例(48.4%)，见表1。其中病理结果为 CIN Ⅱ+的患者为 30 例(48.4%,30/62)，病理结果为 CIN Ⅲ+的患者为 26(41.9%,26/62)例。
2.cutoff值探索：通过ROC曲线分析ASC人群，当AUC面积最大时，PAX1甲基化检测CIN Ⅱ+的最佳临界点为8.8，ZNF582甲基化检测CIN Ⅱ+的最佳临界点为11.1。
表1 ASC人群特征及基础数据
变量例数构成比(%)细胞学结果 ASCUS20376.6 ASC-H6223.4病理学结果 ASCUS 正常/炎症8642.4 CINⅠ6532.0 CINⅡ3014.8 CINⅢ/CIS/AIS188.9 SCC/AC42.0 ASC-H 正常/炎症3048.4 CINⅠ23.2 CINⅡ46.5 CINⅢ/CIS/AIS1829.0 SCC/AC812.9HPV检测结果 ASCUS 阴性6632.5 阳性14772.4 ASC-H 阴性1219.4 阳性4064.5合计265
3.三种不同检测方法在ASCUS人群中检测CIN Ⅱ+、CIN Ⅲ+的诊断效能分析：ASCUS人群中，HPV检测CIN Ⅱ+的灵敏度是90.6%，特异度是64.7%；PAX1甲基化检测CIN Ⅱ+的灵敏度是83.0%，特异度是87.3%；ZNF582甲基化检测CIN Ⅱ+的灵敏度是71.7%，特异度是92.0%。三种检测方法两两比较，当检测CIN Ⅱ+时，PAX1甲基化的ROC曲线下面积大于HPV检测(Z=2.182,P=0.029)，HPV检测与ZNF582甲基化检测ROC曲线下面积无明显差异(Z=1.262,P=0.206)，两种基因甲基化检测CIN Ⅱ+的ROC曲线下面积无明显差别(1.208,P=0.227)，见表2。使用ROC曲线比较三种检测方法在ASCUS人群中检测CIN Ⅱ+的AUC面积，PAX1甲基化的AUC面积最大(AUC=86.2%)，见图1A。
ASCUS人群中，HPV检测CIN Ⅲ+的灵敏度是100.0%，特异度是56.7%；PAX1甲基化检测CIN Ⅲ+的灵敏度是91.3%，特异度是82.8%；ZNF582甲基化检测CIN Ⅲ+的灵敏度是91.4%，特异度是95.0%。三种检测方法两两比较，PAX1甲基化检测CIN Ⅲ+的ROC曲线下面积大于HPV检测(Z=2.716,P=0.007)，ZNF582甲基化检测CIN Ⅲ+的ROC曲线下面积大于HPV检测(Z=3.958,P=0.001),但是两种基因甲基化检测CIN Ⅲ+的ROC曲线下面积无明显差别(2.250,P=0.024)，见表2。使用ROC曲线比较三种检测方法在ASCUS人群中检测CIN Ⅲ+的AUC面积，ZNF582甲基化检测AUC面积最大(AUC=95.5%)，见图1B。
4.三种检测方法在ASC-H中检测CIN Ⅱ+、CIN Ⅲ+的诊断效能分析：ASC-H 人群中，HPV检测CIN Ⅱ+的灵敏度是100.0%，特异度是37.5%；PAX1甲基化检测CIN Ⅱ+的灵敏度是90.0%，特异度是90.6%；ZNF582甲基化检测CIN Ⅱ+的灵敏度是90.0%，特异度是96.9%。三种检测方法两两比较，PAX1甲基化检测CIN Ⅱ+的ROC曲线下面积大于HPV检测(Z=3.668，P<0.001)，ZNF582甲基化检测CIN Ⅱ+的ROC曲线下面积大于HPV检测(Z=3.578，P<0.001),两种基因甲基化检测CIN Ⅱ+的ROC曲线下面积无明显差别(0.241，P=0.809),见表3。使用ROC曲线比较三种检测方法在ASC-H人群中检测CIN Ⅱ+的AUC面积，PAX1甲基化的AUC面积最大(AUC=94.6%)，见图2A。
ASC-H人群中，HPV检测CIN Ⅲ+的灵敏度是100.0%，特异度是33.3%；PAX1甲基化检测CIN Ⅲ+的灵敏度是88.5%，特异度是80.6%；ZNF582甲基化检测CIN Ⅲ+的灵敏度是96.2%，特异度是94.4%。三种检测方法两两比较，PAX1甲基化检测CIN Ⅲ+的ROC曲线下面积大于HPV检测(Z=3.331，P<0.001),ZNF582甲基化检测CIN Ⅲ+的ROC曲线下面积大于HPV检测(Z=4.111,P<0.001)，两种基因甲基化检测CIN Ⅱ+的ROC曲线下面积无明显差别(Z=1.444,P=0.149)，见表3。使用ROC曲线比较三种检测方法在ASC-H人群中检测 CIN Ⅲ+的AUC面积，ZNF582甲基化检测AUC面积最大(AUC=96.0%)。见图2B。
表2 三种检测方法在ASCUS人群中检测CIN Ⅱ+和CIN Ⅲ+的诊断效能
检测方法SE(%)SP(%)PPT(%)NPT(%)LR-LRAUCAUC95%CICINⅡ+ HPV(Hc2)90.664.743.895.82.560.150.780.71^0.83 PAX183.087.366.694.46.550.190.860.81^0.91 ZNF58271.792.073.291.48.960.310.830.77^0.88CINⅢ+ HPV(Hc2)100.056.730.2100.02.310.000.280.72^0.84 PAX191.382.849.898.15.300.110.910.86^0.94 ZNF58291.495.077.498.318.260.090.960.92^0.98
A为不同检测方法诊断 ASCUS 患者中 CINⅡ+的 ROC 曲线、B为不同检测方法诊断 ASCUS 患者中 CINⅢ+的 ROC 曲线；HPV、PAX1、ZNF582分别指 HPVDNA 定性检测、PAX1 甲基化检测、ZNF582 甲基化检测
图1 不同检测方法诊断 ASCUS 患者中 CIN Ⅱ+、CIN Ⅲ+的 ROC 曲线
表3 三种检测方法在 ASC-H 人群中检测 CIN Ⅱ+和CIN Ⅲ+的诊断效能
检测方法SE(%)SP(%)PPT(%)NPT(%)LR-LRAUCAUC(95%CI)CINⅡ+ HR-HPV(Hc2)100.037.560.0100.01.6000.690.56^0.80 PAX190.090.690.090.69.600.110.950.87^0.99 ZNF58290.096.996.491.228.800.100.950.86^0.99CINⅢ+ HR-HPV(Hc2)100.033.352.0100.01.0100.670.54^0.78 PAX188.580.676.790.64.550.140.920.82^0.97 ZNF58296.294.492.697.117.310.040.960.88^0.99
图2 不同检测方法诊断 ASC-H 患者中 CINⅡ+、CINⅢ+的 ROC 曲线
5.三种不同检测方法在ASC人群中检测CIN Ⅱ+、CIN Ⅲ+的诊断效能分析：ASC人群中，HPV检测CIN Ⅱ+的灵敏度是94.0%，特异度是59.9%；PAX1甲基化检测CIN Ⅱ+的灵敏度是85.5%，特异度是87.9%；ZNF582甲基化检测CIN Ⅱ+的灵敏度是78.3%，特异度是92.9%。三种检测方法两两比较，PAX1甲基化检测CIN Ⅱ+的ROC曲线下面积大于HPV检测(Z=3.723,P<0.001)，ZNF582甲基化检测CIN Ⅱ+的ROC曲线下面积大于HPV检测(Z=3.032,P=0.002)，两种基因甲基化检测CIN Ⅱ+的ROC曲线下面积无明显差别(0.942,P=0.346)，见表4。使用ROC曲线比较三种检测方法在ASC人群中检测CIN Ⅱ+的AUC面积，PAX1甲基化的AUC面积最大(AUC=89.1%)，见图3A。
ASC人群中，HPV检测CIN Ⅲ+的灵敏度是100.0%，特异度是52.8%；PAX1甲基化检测CIN Ⅲ+的灵敏度是87.8%，特异度是82.9%；ZNF582甲基化检测CIN Ⅲ+的灵敏度是93.9%，特异度是91.7%。三种检测方法两两比较，PAX1甲基化检测CIN Ⅲ+的ROC曲线下面积大于HPV检测(Z=3.895,P<0.001)，ZNF582甲基化检测CIN Ⅲ+的ROC曲线下面积大于HPV检测(Z=5.763,P<0.001),ZNF582甲基化检测CIN Ⅲ+的ROC曲线下面积大于PAX1甲基化检测(Z=3.407,P<0.001)，见表4。使用ROC曲线比较三种检测方法在ASC人群中检测CIN Ⅲ+的AUC面积，ZNF582甲基化检测AUC面积最大(AUC=96.0%)，见图3B。
表4 三种检测方法在ASC人群中检测CIN Ⅱ+和CIN Ⅲ+的诊断效能
检测方法SE(%)SP(%)PPT(%)NPT(%)LR-LRAUCAUC(95%CI)CINⅡ+ HR-HPV(Hc2)94.059.951.295.72.340.100.770.71^0.82 PAX185.587.976.093.17.080.160.890.85^0.92 ZNF58278.392.983.190.510.960.230.870.83^0.91CINⅢ+ HR-HPV(Hc2)100.052.831.9100.02.120.000.760.71^0.81 PAX187.882.953.193.85.120.150.900.86^0.94 ZNF58293.991.771.498.511.270.070.960.93^0.98
图3 不同检测方法诊断 ASC 患者中CIN Ⅱ+、CIN Ⅲ+的ROC曲线
讨论
本研究表明，在ASC人群中，PAX1、ZNF582甲基化检测CIN Ⅱ+、CIN Ⅲ+的能力比HPV(Hc2)测试更好，这表明PAX1、ZNF582在ASCUS人群的分流具有重要价值。利用DNA甲基化作为宫颈癌筛查分子标记物正在探索研究中[6-7]。研究发现，PAX1检测作为潜在生物标志物可用于检测CIN Ⅲ +[8]。关于ASCUS分类的研究中，提示WT1和PCDH10甲基化检测是优于HPV检测[9-10]。研究发现，不论是ASCUS人群还是ASC-H人群，PAX1甲基化测试检测 CIN Ⅱ+的诊断能力较好。中国台湾一项研究发现，ZNF582甲基化检测在低度鳞状上皮内病变分流诊断中发挥作用。在PTPRR、SOX1、PAX1、ZNF582四个甲基化基因中，发现ZNF582是检测CIN Ⅲ +的最好的生物标志物[11]。本研究发现，在ASCUS人群中ZNF582甲基化检测CIN Ⅱ+的灵敏度是71.7%，特异度是92.0%；ZNF582甲基化检测CIN Ⅲ+的灵敏度是91.4%，特异度是95.0%。本研究发现，在ASC-H人群中，ZNF582甲基化检测CIN Ⅱ+的灵敏度是90.0%，特异度是96.9%；ZNF582甲基化检测 CIN Ⅲ+的灵敏度是93.9%，特异度是91.7%。由此可以看出，ZNF582甲基化测试在ASCUS人群中检测CIN Ⅱ+和CIN Ⅲ+的诊断能力较好，ZNF582可以作为 ASC-H人群分流的生物标记物。
本研究提示，PAX1/ZNF582甲基化检测可以增加ASC(ASCUS &ASC-H)人群检出CIN Ⅱ+/CIN Ⅲ+的特异度，由此可以大胆尝试对细胞学为 ASCUS/ASC-H 人 群 进 行 PAX1/ZNF582 基 因 甲 基 化 检 测 ,结 果 提 示为PAX1/ZNF582甲基化阳性者，可进行阴道镜检查；甲基化阴性者可一年后复查，这样可减轻患者不必要的经济和心理负担。基因甲基化检测作为一种无创的检测方法，不仅患者容易接受，而且可减少阴道镜转诊的数量，减少过度治疗。当然，这一假想还有待将来的研究验证。此外，甲基化检测在宫颈癌术后随访中的应用价值也尚待证明，同样需要更多的研究去验证。
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