表1 RIF患者经LIT治疗后首次移植周期时的
基本资料构成
LIT治疗后首次移植周期时的基本指标数据反复着床失败(例)62女方年龄(岁)31.2±4.3女方RIF年龄(岁)32.6±4.3男方年龄(岁) 33.0±5.4男方RIF年龄(岁) 34.3±5.4原发不孕(例)46继发不孕(例) 16不孕年限(年) 4.7±2.9既往移植次数(次)4.3±1.2此次移植周期辅助口服阿司匹林联合/不联合强的松(例)40新鲜周期移植(例)24解冻周期移植(例)37
·生殖医学·
近年，体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)周期的着床率始终徘徊在30%～40%，其中反复着床失败(recurrent implantation failure，RIF)的发生率约在5%～11.1%[1]，这成为困扰临床工作的一大难题。
胚胎的成功着床要求囊胚与子宫内膜同步发育且功能协调，它是母胎免疫耐受顺利建立的结果。研究表明，子宫内膜中有许多免疫细胞，如T辅助细胞1型(Th1)、T辅助细胞2型(Th2)、树突状细胞、单核巨噬细胞、自然杀伤细胞，这些均是参与着床的重要细胞[2]。文献表明，在IVF-ET失败的患者中，血清抗磷脂抗体较无着床失败的不孕患者也有所升高[3]。研究表明，抗核抗体(antinuclear antibody，ANA)可干扰胚胎着床[4]。此外，许多细胞因子也都通过直接或间接作用调节妊娠过程，如白细胞介素-6家族[5]，包括白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)、白细胞介素-6(interleukin，IL-6)和白细胞介素-11(interleukin-11，IL-11)。因此，从免疫方面治疗反复着床失败的方法应运而生，如宫腔灌注外周血单核细胞[6-7]、口服免疫制剂[8]、宫腔灌注人促绒毛膜性腺激素[9]及宫腔灌注粒细胞集落刺激因子[10]等，这些方法均取得一定疗效。
早在1994年Carp等[11]应用患者丈夫的白细胞(淋巴细胞和单核细胞)免疫治疗反复IVF失败患者，该研究入组了10名年龄在20～40岁的患者且3次IVF助孕未获得妊娠的患者，并检测患者体内抗丈夫补体依赖抗体阴性。将从患者丈夫外周血中分离的白细胞注射至患者前臂皮下，4周后重复注射1次，2次注射后两周检测患者体内抗丈夫补体依赖抗体如为阳性可进行下次胚胎移植，如为阴性需进行第3次注射，结果10名患者共经历了30个IVF周期，6名患者获得妊娠，周期临床妊娠率为20%，并未有提高。之后鲜有报道应用免疫治疗方法治疗反复IVF失败患者。
本研究回顾性总结因RIF行淋巴细胞主动免疫治疗(lymphocyte immunotherapy，LIT)的62例患者的临床资料，观察其临床疗效及其影响因素。
1.一般资料：2012年1月—2016年12月在本院生殖中心助孕，且至少连续行3个胚胎移植周期(新鲜或解冻移植周期)且每周期移植1～2枚优质胚胎未获得临床妊娠、并行LIT治疗的患者，共62例。
2.方法：采用临床观察资料分析方法，研究资料采集自北京大学第三医院生殖中心数据库、门诊病例及电话病史询问。
3. 淋巴细胞主动免疫治疗：常规消毒后，抽取供者上肢静脉血20 ml，用适量肝素抗凝，37℃水浴30 min，取上清，置于5 ml磷酸盐缓冲液(PBS)中，混匀，将混匀液缓缓加入另一含10 ml淋巴分离液的离心管中；1 500 r/min离心10 min，收集淋巴细胞并置于5 ml PBS液中平衡，2 000 r/min离心10 min，去上清，加PBS液5 ml混匀；1 500 r/min离心5 min；去上清，将淋巴细胞团置于0.9%氯化钠1 ml中混匀备用。取少许混悬液，计数淋巴细胞，调密度达(40～70)×106/ml，于女方前臂内侧等份皮内注射4～9个点，每2周1次，行淋巴细胞免疫治疗4次后行胚胎移植，确定妊娠后再行2次上述治疗。
4. 主要分析指标：夫妻双方行第一次IVF助孕时的年龄(即女方年龄和男方年龄)、夫妻双方诊断为RIF时的年龄、不孕类型、不孕年限、免疫治疗前共移植次数(既往移植次数)、患者免疫治疗前应用过的其他治疗方法及治疗效果、免疫治疗后移植妊娠结局、移植前是否辅助药物治疗、此次移植周期为新鲜周期或解冻周期，此次移植周期的胚胎着床率和临床妊娠率。
5.统计学处理：应用SPSS 17.0统计软件，计量资料经正态性检验均符合正态分布，以均数±标准差表示，采用t检验分析；计数资料采用卡方检验分析；多因素分析采用Logistic回归分析；检验结果以P<0.05为差异有统计学意义。
1.资料总体构成：由表1可知，本次研究入组的62例RIF患者的女方平均年龄为(31.2±4.3)岁，男方平均年龄(33.0±5.4)岁，其诊断RIF时的女方和男方平均年龄分别为(32.6±4.3)岁和(34.3±5.4)岁，62例RIF患者的平均不孕年限为(4.7±2.9)年，其中原发不孕患者46例，继发不孕患者16例。
62例RIF患者在行免疫治疗前有57例曾行宫腔镜检查，6例曾行子宫内膜搔刮治疗，15例曾行口服阿司匹林+泼尼松口服治疗。其中有29例在LIT后首次移植获得临床妊娠，1例在免疫治疗后自然妊娠，2例在免疫治疗后第2次移植获得妊娠。29例首次移植后妊娠的患者中有17例已成功分娩，其中一例分娩双胎，其余均为单胎分娩，而4例在妊娠后发生胚胎停育。余8例仍在妊娠中，其中有3例为双胎妊娠。而未获得临床妊娠的32例中有3例在LIT后首次移植后生化妊娠。
2.影响临床结局的因素：根据62例患者免疫治疗后有1例患者自然妊娠，61例患者行胚胎移植，移植胚胎共103枚，其中获得临床妊娠周期29个，共着床胚胎34枚。进而得出免疫治疗后RIF患者首次移植周期的胚胎着床率和移植周期临床妊娠率分别为33.0%(34/103)、47.5%(29/61)。根据免疫治疗后的是否获得临床妊娠将61例患者分为成功组(29例)和失败组(32例)。61 例患者中有40例患者在免疫治疗后首次移植周期辅助口服阿司匹林联合/不联合泼尼松，其中有21例患者获得临床妊娠。此外，成功组患者新鲜周期移植的有9例，解冻周期移植的20例。而失败组患者新鲜周期移植的有15例，解冻周期移植的17例。见表2。
分析两组患者的临床资料，发现RIF患者经LIT治疗后首次IVF周期移植的临床结局与患者不孕年限、不孕类型、既往IVF失败次数、新鲜或解冻移植及此次移植周期是否辅助药物治疗无相关性，只有女方年龄、女方RIF年龄在两组间差异有统计学意义，见表2。将所有变量经多因素Logistic回归分析，发现只有女方RIF年龄为免疫治疗后IVF结局的独立影响因素(P=0.011，OR=1.21，95% CI=1.04～1.39)。
表1 RIF患者经LIT治疗后首次移植周期时的
基本资料构成
LIT治疗后首次移植周期时的基本指标数据反复着床失败(例)62女方年龄(岁)31.2±4.3女方RIF年龄(岁)32.6±4.3男方年龄(岁) 33.0±5.4男方RIF年龄(岁) 34.3±5.4原发不孕(例)46继发不孕(例) 16不孕年限(年) 4.7±2.9既往移植次数(次)4.3±1.2此次移植周期辅助口服阿司匹林联合/不联合强的松(例)40新鲜周期移植(例)24解冻周期移植(例)37
表2 RIF患者免疫治疗后妊娠结局相关的单因素分析
组别例数女方年龄(岁)女方RIF年龄(岁)男方年龄(岁) 男方RIF年龄(岁)不孕年限(年)成功组2929.9±3.5*31.3±3.5*32.1±5.033.3± 5.14.3±2.9失败组3232.5±4.533.9±4.633.9±5.735.3±5.75.1±2.9组别例数既往移植次数(次)不孕类型 [例(%)]原发不孕继发不孕移植周期辅助药物治疗[例(%)]有无移植周期[例(%)]新鲜周期解冻周期成功组294.2±1.223(80.0)6(20.0)21(72.4)8(27.6)9(31.0)20(69.0)失败组324.4±1.322(68.7)10(31.3)19(59.4)13(40.6)15(46.9)17(53.1)
与失败组比较，*P<0.05
本研究入组的62例RIF患者在行免疫治疗后29例患者成功获得临床妊娠。除去免疫治疗后有1例患者自然妊娠，免疫治疗后首次移植周期共61个，免疫治疗后RIF患者的胚胎着床率和移植周期临床妊娠率分别为33.0%、47.5%。本研究与黄向红等[12]的研究结果基本相符，该研究前瞻性随机对照研究入组RIF患者在免疫治疗后新的移植周期的胚胎着床率和移植周期临床妊娠率分别为25.3%和54.8%，较未治疗组明显提高。可见RIF患者再移植周期辅助免疫治疗可改善移植周期妊娠结局。
许多研究已表明免疫稳态的失衡可引起RIF，Liang等[13]和Nakagawa等[8]的研究均表明辅助型T1细胞、辅助型T2细胞在RIF的发生中发挥一定作用。此外，Miko等[14]研究还发现IVF助孕失败的患者外周血中NK细胞及NKT细胞亚群中的1类细胞增多。Fukui等[15]也做了一项关于外周血清NK细胞的研究，发现分泌肿瘤坏死因子-γ和肿瘤坏死因子-α的CD56brightNK细胞的比例在反复自发性流产和RIF的女性中显著高于健康妇女，而分泌白细胞介素-4和白细胞介素-10的CD56brighNK细胞的比例在反复自发性流产和RIF的女性中显著低于健康妇女。由此可见，淋巴细胞在RIF的发病机制中起着至关重要的作用，而淋巴细胞免疫治疗也基于此。
不仅细胞的数量变化可影响胚胎着床，细胞分泌的细胞因子也参与调节着床过程，许多细胞因子也都通过直接或间接作用调节妊娠过程，如白细胞介素-6家族[5]，包括白血病抑制因子(LIF)、白细胞介素-6和白细胞介素-11。已有研究表明，对于不明原因复发性流产的患者行LIT治疗后T淋巴细胞亚型数量和比例发生改变，且有些改变利于妊娠的维持[16-17]。因此，淋巴细胞主动免疫治疗或可通过改变细胞因子的种类和数量来调节妊娠。
此外，本研究根据其首次移植的妊娠结局将患者分为两组，即移植成功组29例和移植失败组32例。分析两组患者的临床资料，发现RIF患者经LIT治疗后首次IVF周期移植的临床结局与患者不孕年限、不孕类型、既往IVF失败次数、新鲜或解冻移植及此次移植周期是否辅助药物治疗无相关性，而患者诊断RIF时的年龄是LIT后首次移植临床结局的独立影响因素，失败组患者诊断RIF时的年龄偏大，LIT治疗后首次移植的成功几率低。年龄不仅是女性生育力下降的因素，也是胚胎着床失败的因素。Ocal等[18]的研究表明，RIF患者的平均年龄较非RIF患者平均年龄高，且差异具有统计学意义。Tan等[19]研究也发现，年龄是影响IVF结局的独立影响因素，年龄<30岁的不孕患者有较好的IVF结局。
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