邻苯二甲酸酯(phthalates, PAEs)是一类典型的环境分泌干扰物，对人体具有内分泌干扰作用[1]。有研究指出，多种PAEs广泛存在于大气颗粒物、水体、土壤中，可通过呼吸道、胃肠道、皮肤接触进入机体[2-4]，并可在胎盘、脐带组织中检出PAEs[5]，孕期PAEs暴露与稽留流产、早产等不良出生结局的发生有关[6-7]。在以往针对孕妇人群的研究中，大多数研究者通过测定孕妇血、胎盘组织、脐带血、尿液等生物样本中的PAEs含量[7-9]，表征孕妇的短、中期暴露水平，少有研究利用头发样本测定长期暴露水平。此外，研究表明，膳食是PAEs暴露的重要途径之一[10-12]。本研究拟选取北京市海淀区孕期妇女，测定其头发样本中9种PAEs浓度，分析北京市孕妇人群PAEs长期暴露水平，并探讨膳食因素对污染物浓度水平的影响。
对象与方法
一、人群来源
研究对象来源于北京大学生育健康研究所在海淀妇幼保健院建立的孕期队列。孕妇募集条件为：(1)自2017年10月至2018年10月在海淀区妇幼保健院建立孕期健康档案；(2)孕周小于20周；(3)签署知情同意书。向孕妇发放调查问卷，收集社会人口学信息，并采集孕妇头发样本。本研究从符合条件的人群中以随机数法随机抽取152例孕妇纳入分析。该研究获得北京大学伦理审查委员会批准。
二、研究方法
1.基本信息收集：通过发放调查问卷，收集孕妇的基本特征以及近一个月的膳食频率。基本特征包括孕妇年龄、BMI、民族以及受教育程度。膳食频率调查主要包括蔬果类、蛋奶类、食用肉类、水产品类、碳酸饮料以及茶品饮用频率。
2.样本采集及污染物测定：从孕妇枕后部发根处剪取12～24 cm长的头发样本，铝箔包裹发根侧，装入密封袋中留存。将样本运送至北京大学中心实验室测定头发样本中PAEs含量。共测定9种PAEs，包括邻苯二甲酸二甲酯(dimethyl phthalate，DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(diethyl phthalate，DEP)、邻苯二甲酸二异丁酯(diisobutyl phthalate，DIBP)、邻苯二甲酸双(2-甲氧基乙)酯[bis(2-Methoxyethyl)phthalate，DMEP]、邻苯二甲酸双-4-甲基-2-戊酯[bis(4-Methyl-2-pentyl)phthalate，DMPP]、邻苯二甲酸双-2-乙氧基乙酯[bis(2-Ethoxyethyl)phthalate，DEEP]、邻苯二甲酸二丁氧基乙酯[bis(2-n-butoxyethyl)phthalate，DBEP]、邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯[bis(2-Ethylhexyl)phthalate ，DEHP]和邻苯二甲酸二壬酯(dinonyl phthalate，DNP)；使用的内标为邻苯二甲酸二丁酯-D4(di-N-butyl phthalate-D4，DBP-D4)、 邻苯二甲酸二异丁酯-D4(diisobutyl phthalate-D4，DIBP-D4)、邻苯二甲酸二苯酯-D4(diphenyl phthalate-D4，DPP-D4)。
3.头发样本前处理流程：称量研磨好的头发粉末约60 mg，加入1.2 mL乙腈溶液，置于40℃孵化器中过夜(约17 h)萃取。离心，取上清液，氮吹至近干，加入0.6 mL盐酸溶液(pH=2)复溶；加入0.6 mL环己烷：乙酸乙酯(4：1，v/v)溶液开展液液萃取三次，留存上清液。加入20 ng内标物质标定，将体系氮吹至近干，加入150 μl正己烷溶液。使用三重四极杆气相色谱-质谱联用仪(GC-MSMS)测定PAEs浓度。各PAEs的测定目标离子对、保留时间以及对应的内标物质信息见表1。
表1 邻苯二甲酸酯测定离子对，保留时间以及对应内标
Table 1 The quantitative transition, retention time, and internal standards of phthalates
PollutantsQuantitative transitionRetention time (min)ISaDMP163.5 > 77.09.48DIBP-D4DEP177.0 > 149.012.15DIBP-D4DIBP148.7 > 121.017.58DIBP-D4DMEP149.0 > 121.020.11DBP-D4DMPP149.0 > 121.021.60DBP-D4DEEP149.0 > 121.022.24DBP-D4DBEP149.0 > 121.028.22DPP-D4DEHP149.4 > 121.029.33DPP-D4DNP148.7 > 121.034.79DPP-D4DIBP-D4153.1 > 125.017.55-DBP-D4152.6 > 125.019.35-DPP-D4152.7 > 125.022.80-
a IS:Internal standards
4. 统计学处理：以35岁为截断值，将孕妇年龄划分为两组；以24 kg/m2为截断值，将BMI划分为两组。使用中位数和四分位数描述各污染物浓度分布特征。将各污染物浓度以其中位数划分为浓度等级。对于膳食变量，根据人群不同类别膳食频率分布的不同，以不同的频率界值划分：蔬果类与蛋奶类以7次/周划分频率等级；食用肉类以3次/周频率划分；水产品类，碳酸饮料以及茶品饮用以“有/无”频率划分。将PAEs浓度二分类变量作为结局，年龄与BMI作为混杂变量，构建Logistic回归模型，探究膳食因素对PAEs浓度的影响。使用SAS Studio University Edition©进行数据处理与分析，所有的检验显著性水平为P <0.05。
结 果
一、人群特征
本研究共纳入152例孕妇进行分析。孕妇年龄(29.9±3.6)岁，其中大部分孕妇小于35岁(88.1%)，大部分为汉族(97.3%)且具有本科及以上学历(74.3%，113/152)，大部分孕妇BMI在超重水平以下(75.9%)。见表2。
表2 北京市海淀区孕妇基本特征描述(N=152)
Table 2 Characteristics of pregnant women (N=152) in Haidian District, Beijing
CharacteristicsFrequencyPercent (%)Age(years) <3513488.1 ≥35 1811.8Ethnicity Han14897.3 Others42.6BMI(kg/m2) <24104#75.9 ≥2433#24.0Education Postgraduate and a-bove 4328.2 Undergraduate 7046.0 Junior college 2818.4 High school and below 117.2
#The total number may not be equal to the number of whole participants due to missing or unknown data.
二、北京市海淀区孕妇头发中PAEs浓度水平
北京市海淀区孕妇头发中各PAEs均有不同程度的检出，检出率为55.9%～98.0%。其中DEP、DEHP和DNP的检出率同时达到98.0%。所有污染物经检验均不符合正态分布(P <0.05)。9种PAEs总和中位数浓度(四分位数)为3 361.7(1 575.6，6 807.7)ρg/mg，其中DEHP浓度最高，达到1 837.5(6 41.7，4 473.3)ρg/mg。见表3。
表3 北京市海淀区孕妇(N=152)头发中PAEs浓度(ρg/mg)
Table 3 Hair concentration (ρg/mg) of phthalates among 152 pregnant women in Haidian District, Beijing
PollutantsDetection rate (%)P25MedianP75DMP84.214.035.258.5DEP98.075.7140.2213.2DIBP55.990.9255.5496.1DMEP92.775.199.9160.4DMPP88.1160.3196.2268.4DEEP95.3274.1400.4673.9DBEP75.057.570.993.5DEHP98.0641.71 837.54 473.3DNP98.014.118.823.2∑PAEs-1 575.63 361.76 807.7
三、孕妇膳食频率与头发中PAEs浓度的关联
根据本研究人群9种PAEs浓度中位数，将各污染物暴露水平分为两组。以暴露水平(二分类)为结局，构建Logistic回归模型，结果见表4。在调整年龄与BMI因素后，孕妇较多食用水产品类与头发中高水平DEEP之间存在微弱关联，调整OR=1.89(95% CI：0.94～3.80)；食用油炸类食物与头发中高水平DEHP之间存在微弱关联，调整OR=2.36(95% CI：0.96～5.81)；食用蛋奶类食物与低水平DMP之间存在微弱关联，调整OR=0.44(95% CI：0.19～1.00)；然而，本研究还发现孕妇较多食用蛋奶类食物与头发中低水平DNP显著相关，调整OR=0.29(95% CI：0.12～0.66)。
四、不同研究人群头发中PAEs浓度比较
将本研究结果与其他以往研究[13]头发中PAEs浓度进行比较，发现本研究人群头发中4种PAEs(DMP、DEP、DIBP、DEHP)中位数浓度均低于以往研究[13]，其中DMP浓度与以往研究[13]的浓度值接近，见表5。
讨 论
本研究发现，北京市海淀区孕妇人群头发样本可检出多种PAEs，大多数PAEs浓度均低于以往研究结果[13]，处于较低水平。孕妇食用蛋奶类食物与DNP、DMP水平有关；食用油炸食物与DEHP有关；食用水产品与DEEP有关。
表4 孕妇膳食频率与头发中PAEs浓度的关联
Table 4 Associations between the hair concentrations of 9 phthalates and food frequencies
Food frequencies (Reference group)Adjusted OR (95%CI) aDMPDEPDIBPDMEPDMPPVegetable &Fruit (<7 times/week)0.78(0.39-1.59)0.55(0.27-1.11)1.20(0.55-2.60)1.01(0.50-2.04)1.06(0.52-2.15)Egg &Milk (<7 times/week)0.44(0.19-1.00)0.52(0.24-1.13)1.11(0.49-2.52)0.77(0.36-1.66)0.62(0.28-1.35)Meat (<3 times/week)0.91(0.45-1.84)0.78(0.39-1.55)0.65(0.31-1.39)0.93(0.47-1.87)0.78(0.39-1.58)Aquatic Products (No)0.70(0.35-1.42)0.80(0.40-1.58)0.77(0.36-1.64)1.55(0.77-3.11)0.75(0.38-1.52)Fried foods (No)0.65(0.26-1.62)1.71(0.71-4.15)1.49(0.59-3.74)0.84(0.35-2.02)0.69(0.28-1.71)Soda drink (No)1.22(0.38-3.93)1.15(0.36-3.68)0.75(0.19-2.91)0.73(0.22-2.40)1.25(0.39-4.02)Tea (No)1.88(0.38-9.37)0.76(0.15-3.77)1.13(0.20-6.38)1.72(0.35-8.52)0.66(0.12-3.81)Food frequencies (Reference group)Adjusted OR (95%CI) aDEEPDBEPDEHPDNP∑PAEVegetable &Fruit (<7 times/week)0.58(0.29-1.16)0.74(0.36-1.53)0.61(0.30-1.22)0.71(0.35-1.43)0.71(0.35-1.43)Egg &Milk (<7 times/week)0.63(0.30-1.35)0.56(0.25-1.27)0.70(0.33-1.50)0.29(0.12-0.66)0.69(0.29-1.66)Meat (<3 times/week)0.91(0.45-1.80)0.60(0.29-1.24)1.08(0.54-2.16)0.68(0.34-1.37)0.99(0.49-1.99)Aquatic Products (No)1.89(0.94-3.80)0.83(0.40-1.71)0.85(0.43-1.69)0.61(0.31-1.23)0.89(0.44-1.77)Fried foods (No)1.12(0.42-2.65)0.80(0.32-2.05)2.36(0.96-5.81)1.34(0.56-3.23)2.04(0.84-4.98)Soda drink (No)1.32(0.42-4.19)1.75(0.54-5.66)1.81(0.56-5.92)1.34(0.41-4.38)1.35(0.42-4.37)Tea (No)1.65(0.34-8.10)0.95(0.16-5.53)0.82(0.17-4.04)0.42(0.07-2.44)0.90(0.18-4.54)
a Calculated by establishing logistic regression model adjusted for maternal age and BMI
表5 不同研究人群头发中PAEs浓度比较(ρg/mg)
Table 5 Comparison of hair phthalates concentrations in different studies (ρg/mg)
ReferencesCountry-RegionPopulationDMPDEPDIBPDEHPThe currentstudyaChina-BeijingPregnant women35.2140.2255.51 837.5He MJ, et.al[13]China-ChongqingVolunteers-rural100.012 000.07 250.032 100.0Volunteers -urban62.4 1 440.01 990.0 5 890.0
a Calculated by establishing logistic regression model adjusted for maternal age BMI
头发样本相比于其他常用的生物样本(血标本、尿液标本等)，具有易采集、易储存、分析成本低等优势；更重要的是，头发样本可以表征机体的长期暴露水平，相比仅能表征短、中期的生物样本，头发样本的长期暴露表征能力可以更加稳定地反映机体一段时间内的暴露水平。并且，利用头发样本相对恒定的生长速率，可为研究者提供以往的暴露水平，在研究中可以增强因果推断的时序性。
本研究测定了北京市海淀区孕妇人群头发样本9种PAEs含量，且检出率普遍较高，为本地孕妇人群的污染物暴露水平提供了一定参考。既往利用头发样本测定PAEs长期暴露水平的研究较少，且测定的污染物种类与数目较少，仅查到一篇测定并详细汇报头发样本中PAEs含量的既往研究[13]，该研究于中国重庆地区开展，测定了农村与城市两组居民头发中PAEs含量。北京市海淀区孕妇群体头发中DMP浓度水平与重庆地区城市居民人群的结果较为接近；其他PAEs浓度均明显低于重庆地区居民结果[13]，受试人群的选择以及地域的异质性可能是导致污染物浓度差别较大的原因。此外，不同研究头发样本前处理流程以及分析测定方法不尽相同，也一定程度上降低了研究之间污染物浓度的可比性：重庆地区所使用的测定仪器为高效液相色谱-时间飞行质谱联用仪(UPLC-Q-TOF-MS)，测定灵敏度较高，可能是该研究头发样本中PAEs浓度偏高的原因。
本研究通过调整年龄与BMI，对孕妇膳食频率与PAEs浓度水平进行分析后，发现孕妇食用较多油炸食品与高浓度DEHP微弱相关，食用水产品与高浓度DEEP微弱相关。Dickson-Spillmann等[12]研究者在其膳食调查中发现，“高脂肪、高糖以及快餐类”食物与高水平DEHP有关，本研究结果与其研究结论一致。
有研究指出，在大多数蛋奶类食物中未检出DNP[10]，提示机体膳食摄入(尤其是蛋奶类食物)可能与DNP暴露无关。但本研究发现，孕妇食用蛋奶类食物与较低水平DNP显著相关。此外，Colacino等[11]研究者在分析2003—2004年的美国国家健康与营养调查(NHANES)数据时发现，控制年龄、种族、性别与BMI后，水果摄入与尿液中的高分子量PAEs代谢产物以及总DEHP代谢产物均呈负相关，与本研究结果类似。因此，上述结果提示食用蛋奶类食物可能与机体的邻苯二甲酸酯低暴露水平有关。但是其具体的作用机制，仍需要后续研究进行深入分析与探讨。
本研究存在一定不足之处。本研究采用问卷调查的方式，仅获取孕妇近一个月以来的各类食物摄入频率，并未详细询问孕妇每次膳食用量，调查内容相对粗糙；并且所填内容具有回顾性，存在一定回忆偏倚。此外，本研究未获取受试者的食物样本，无法分析各类食物中PAEs的含量，以做进一步探讨。尽管如此，本研究利用孕妇头发样本测定多种PAEs浓度，评估了北京市海淀区孕妇PAEs长期暴露水平，弥补了以往研究在这一领域的数据空白。此外，本研究在控制了混杂因素的情况下，发现多种不同类型的膳食摄入与特定PAEs浓度之间存在关联，提示孕妇膳食摄入与这些污染物暴露有关，并发现孕妇食用蛋奶类食物与低水平PAEs有关。
综上所述，本研究提供了北京市海淀区孕妇头发中多种PAEs暴露浓度。总的来看，本地区孕妇PAEs暴露处于较低水平。本研究发现多种食物膳食摄入与特定PAEs暴露存在关联，食用蛋奶类食物可能是降低PAEs暴露的保护因素。
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