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海南地区妊娠期高血压疾病患者母胎LMP和HLA-DM基因共享率研究

韩贞艳 陈建林 关红琼

【摘要】 目的 探讨海南地区母胎LMP和HLA-DM基因共享率与妊娠期高血压疾病发病的关系。 方法 选择2016年8月—2018年8月在本院产科住院分娩的妊娠期高血压疾病母胎共60例，另外选择在同期本院分娩的正常母胎200对作为对照组。所有研究对象进行血样采集，提取外周血白细胞DNA。然后PCR 扩增后进行基因测序。比较妊娠期高血压疾病患者和正常产妇母胎基因LMP和HLA-DM共享率的差异。 结果 当HLA-DM为2个共享时，妊娠期高血压疾病组比例明显高于正常组，具有显著性差异(P<0.01)。当LMP为4个共享时，妊娠期高血压疾病比例明显高于正常组，具有显著性差异(P<0.01)。妊娠期高血压疾病组患者HLA-DMB* 0103位点、LMP2-R/H基因共享率最高，与对照组比较具有显著性差异(P<0.05)。其余位点共享率没有显著性差异(P>0.05)。 结论 海南地区妊娠期高血压疾病发病可能与母胎HLA-DM基因共享和LMP基因共享率有关，其中HLA-DMB* 0103、LMP2-R/H可能是妊娠期高血压疾病的易感基因。

【关键词】 妊娠期高血压疾病； LMP； HLA-DM； 基因共享率

妊娠期高血压疾病是一种常见的妊娠期疾病，严重影响孕妇和胎儿的身体健康，也是孕产妇和围生儿发病和死亡的主要原因之一。妊娠期高血压疾病的发生有特殊的遗传学和免疫遗传学因素[1]。研究发现，人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)特异性的基因表达与妊娠期高血压的发生具有密切的关系[2]。巨大多功能蛋白酶体(large multifunctional protease，LMP) 在物理图谱上与HLA 基因连锁，其表达产物参与HLA 抗原加工递呈。研究发现LMP和HLA-DM与孕妇重度子痫前期发生有关，且夫妻间的基因共享与疾病发生具有显著关系[3]。也有研究发现，母胎共享LMP基因与重度子痫前期有关[4]。但是，母胎LMP和HLA-DM基因共享与妊娠期高血压疾病发生是否存在关联尚无定论。不同地区人群存在基因多态性，基因表达存在一定的差异[5]。本研究针对海南地区妊娠期高血压疾病患者母胎LMP和HLA-DM基因共享率进行了相关研究，期望为临床诊断和治疗提供帮助。对于基因筛查，早期疾病预防具有重要的临床意义。

对象与方法

一、研究对象

选择2016年8月—2018年8月在海南医学院第二附属医院产科住院分娩的妊娠期高血压疾病母胎共60对，所有患者依据《妊娠期高血压疾病诊治指南(2015)》[6]确诊为妊娠期高血压疾病。年龄(26～42)岁，平均年龄(30.1±3.2)岁，平均分娩孕周(35.4±3.7)周。排除糖尿病、慢性高血压及严重心脑血管疾病病史，精神障碍类疾病史，存在不良生活习惯(如吸烟、酗酒、滥用药物)。另外选择在同期本院分娩的正常产妇和胎儿200对作为对照组，年龄(23～40)岁，平均年龄(28.6±5.2)岁，平均分娩孕周(36.31±2.88)周。两组研究对象一般基本资料没有统计学差异(P>0.05)。

二、研究方法

1. DNA提取与保存:所有研究对象进行血样采集，用EDTA抗凝采血管抽取孕妇静脉血2 mL及胎盘娩出前脐静脉血2 mL，离心分离血浆，采用酚/氯法提取外周血白细胞DNA。

2.基因检测:首先进行PCR 扩增:引物设计、PCR反应条件如表1所示。PCR扩增后进行基因测序。

3.基因分型及母胎共享测定:采用LMP和HLA基因数据库，通过Utype分型软件对测序峰图进行序列分析确定基本基因型。母胎同时存在相关的LMP和HLA基因型即可认定为母胎共享。

4.统计学方法:采用SPSS 22.0进行统计学数据分析，两组患者计量资料采用表示，采用t检验分析统计学差异。计数资料采用卡方检验(基因频率低时，采用Fisher精确检验)，P<0.05为差异有统计学意义。

表1 HLA-DM、LMP各位引物、探针序列及检测方法
Table 1 HLA-DM, LMP primers, probe sequences and detection methods

Gene locusPrimer sequenceAmplifiedfragmentPre-denaturation35 cyclesDenaturationRefoldingExtendExtendedHLA-DMA Third exon5′-GGGTTTCCTATCGCTGAAGTG-3′27994℃, 240 s94℃, 45 s56℃, 45 s72℃, 45 s72℃, 240 s5′-CCAATAGGCAATTGCTGTGTA -3′HLA-DMB Third exon5′-CGGCCACCATCTGTGCAAGT-3′28494℃, 240 s94℃, 60 s58℃, 60 s72℃, 60 s72℃, 240 s5′-CCAGTCCCGAAGGATGGGCTC-3′LMP2-A/B5′-GAACTCCAGAGCTTCATA-3′14095℃, 300 s95℃, 30 s60℃, 30 s72℃, 45 s72℃, 600 s5′-GTGAACCGAGTGTTTGA-3′LMP2-R/H5′-GCCAGCAAGAGCCGAAACAAG-3′25295℃, 300 s95℃, 30 s60℃, 30 s72℃, 45 s72℃, 300 s5′-GTGAACCGAGTGTTTGACAAGC-3′LMP7-A/B5′-TCTACTATGGATGAACATGG-3′76494℃, 240 s94℃, 30 s60℃, 30 s72℃, 45 s72℃, 300 s5′-TTGATTGGCTTCCCGGTACTG-3′LMP7-Q/K5′-CGGACAGATCTCTGGGTGCT-3′30495℃, 300 s95℃, 30 s58℃, 30 s72℃, 45 s72℃, 600 s5′-TCTCCGGGACTGAAGGCTA-3′

结 果

一、妊娠期高血压疾病患者与对照组母胎共享HLA-DM和LMP各基因型数量比较

通过比较妊娠期高血压疾病患者和正常产妇母胎共享HLA-DM和LMP各基因型数量，结果发现，当HLA-DM为2个共享时，妊娠期高血压疾病组比例明显高于正常组，具有显著性差异(P<0.01)。当LMP为4个共享时，妊娠期高血压疾病比例明显高于正常组，差异有统计学意义(P<0.01)，具体见表2所示。

表2 妊娠期高血压疾病患者与对照组母胎共享HLA-DM和LMP各基因型数量比较[例(%)]
Table 2 Comparison of the number of HLA-DM and LMP genotypes between women with pregnancy-induced hypertension and controls[n(%)]

SitePregnancy-induced hypertension(n=60)Control (n=200) HLA-DM 0 shared0(0.0)6(3.0) 1 shared11(18.3)61(30.5) 2 shared39(65.0) ##10(5.0)LMP 0 shared0(0.0)5(2.5) 1 shared3(5.0) #62(31.0) 2 shared17(28.3)66(33.0) 3 shared21(35.0)87(43.5) 4 shared35(58.3) ##15(7.5)

note:Compared with controls,#P<0.05, ##P<0.01

二、HLA-DM各位点基因型在两组母胎间共享率比较

通过比较HLA-DM各位点基因型在两组母胎间共享率，结果发现，在HLA-DMB* 0103位点妊娠期高血压疾病组患者基因共享率最高，与对照组比较具有显著性差异(P<0.05)。其余位点共享率没有显著性差异(P>0.05)，如表3所示。

表3 HLA-DM各位点基因型在两组母胎间共享率比较[例(%)]
Table 3 Comparison of the sharing rate of HLA-DM each genotype between women with pregnancy-induced hypertension and controls[n(%)]

SitePregnancy-induced hypertension (n=60)Control (n=200) HLA-DMA ∗010135(58.3)81(40.5) ∗01025(8.3)15(7.5) ∗01031(6.7)5(2.5)HLA-DMB ∗010119(31.7)68(34.0) ∗01028(16.7)25(12.5) ∗010326(43.3)#21(10.5) ∗01041(6.7)4(2.0)

note:Compared with controls, #P<0.05, ##P<0.01

三、LMP各位点基因型在两组母胎间共享率比较

妊娠期高血压疾病患者LMP2-R/H基因型共享率明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。其他LMP各位点基因共享率没有统计学差异(P>0.05)，如表4所示。

表4 LMP各位点基因型在两组母胎间共享率比较[例(%)]

Table 4 Comparison of the sharing rate of LMP each genotype between gestational hypertension and controls[n(%)]

SitePregnancy-induced hypertension(n=60)Control (n=200) LMP2 LMP2-A/A0(0.0) 8(4.0) LMP2-A/B13(43.3)56(28.0) LMP2-B/B38(63.3)98(49.0) LMP2-R/R6(10.0)83(41.5) LMP2-R/H37(61.7)#12(6.0) LMP2-H/H0(0.0) 2(1.0)LMP7 LMP7-A/A8(16.7)18(9.0) LMP7-A/B24(40.0)35(17.5) LMP7-B/B12(20.0)20(10.0) LMP7-Q/Q1(1.7) 5(2.5) LMP7-Q/K6(10.0)12(6.0) LMP7-K/K32(53.3)108(54.0)

note:Compared with controls,#P<0.05

讨 论

妊娠期高血压疾病属于孕妇常见的高危疾病，是孕产妇死亡的主要原因之一。妊娠期高血压疾病与基因相关。众所周知，胎儿携带一半父亲基因，妊娠的正常需要依赖于母体的免疫耐受。在妊娠过程中，基因共享率越高，母胎相容性越大，那么, 母体就不能识别胚胎抗原，就不能产生封闭抗体, 胚胎得不到封闭抗体的保护而遭到了排斥, 即产生病理妊娠, 如:流产、不孕、子痫前期、早产等。因此，研究母胎基因共享率，对于早期预防和诊断孕妇相关疾病具有重要的意义。

HLA-DM是早期发现的一个基因位点，具有维持未装载抗原肽的空MHC-II类分子的稳定。同时具有促进MHC-II类分子相关稳定和链胎的释放、增强CD4细胞识别和延长抗原肽暴露时间[7]。近年研究发现HLA-DM与子痫前期的发生具有一定关系。朱薏[8]等研究发现，子痫前期夫妇双方共享2个HLA-DM等位基因，子痫前期比例明显升高，说明HLA-DM夫妇基因共享与子痫前期发病存在一定关系。但是，HLA-DMA和HLA-DMB的基因共享率与妊娠期高血压疾病的关系尚不得知。本研究结果发现，妊娠期高血压患者存在HLA-DM为2个共享的比例更高，同时HLA- DMB* 0103位点的比例也高于正常人，说明如果存在HLA-DM共享且超过2个以上，孕妇出现妊娠期高血压发病的风险较高。同时，HLA-DMB* 0103共享率高可能与妊娠期高血压疾病发病存在密切关系。

LMP基因是一种能够加工抗原酶体的亚基，位于人的第6对染色体上的MHC区域上。编码两个活性蛋白LMP2和LMP7。LMP基因使不同个体对同一抗原的免疫应答表现出个体差异，或保护性免疫倾向，或免疫耐受倾向，或自身免疫倾向[9]。张嵩卉[10]等研究发现，LMP基因多态性及其在母胎间共享与子痫前期有显著关联。但没有文献报道LMP基因与妊娠期高血压疾病的关系。本研究发现，当LMP为4个共享时，妊娠期高血压疾病比例显著高于正常组。同时，妊娠期高血压疾病患者LMP2-R/H基因型共享率显著高于对照组。在妊娠期高血压母胎存在LMP基因共享的比例较高，与妊娠期高血压疾病发病存在一定的关系。

综上所述，海南地区妊娠期高血压疾病发病与母胎HLA-DM和LMP共享率具有一定的关系，母胎HLA-DM、LMP基因共享率高对妊娠期高血压疾病的发病率有重要影响。

参考文献

1 Lopez GCA,Mitchell BM.Recent Advances in Immunity and Hypertension.Am J Hypertens,2017,30:643-652.

2 Persson G,Melsted WN,Nilsson LL,et al.HLA class Ib in pregnancy and pregnancy-related disorders.Immunogenetics,2017,69:581-595.

3 Kloesges T,Popa O,Martin W,et al.Networks of gene sharing among 329 proteobacterial genomes reveal differences in lateral gene transfer frequency at different phylogenetic depths.Mol Biol Evol,2011,28:1057-1074.

4 Agius A,Sultana R,Camenzuli C,et al.An update on the genetics of pre-eclampsia.Minerva Ginecol,2018,70:465-479.

5 王香林,赵得雄,庄文婷,等.基因多态性与青海妊娠期高血压疾病的相关性.解剖学报,2018,49:379-386.

6 中华医学会妇产科学分会妊娠期高血压疾病学组.妊娠期高血压疾病诊治指南(2015).中华产科急救电子杂志,2015,4:206-213.

7 Mellins ED,Stern LJ.HLA-DM and HLA-DO,key regulators of MHC-II processing and presentation.Curr Opin Immunol,2014,26:115-122.

8 朱薏,高眉扬.HLA-DM基因夫妇共享率与子痫前期相关性.实用医学杂志,2007,23:2645-2646.

9 Dosenko V,Mykhalchuk DV,Zahoriy V,et al.Allelic polymorphism of genes encoding catalytic immunoproteasome subunits and its functional meaning.Fiziol Zh,2005,51:3-10.

10 张嵩卉,高眉扬,田耕,等.LMP 基因多态性及其在母胎间共享与子痫前期相关性研究.现代妇产科进展,2012,21:175-177.

Association on the sharing rate of maternal fetal LMP and HLA-DM genes in women with pregnancy-induced hypertension in Hainan

HAN Zhenyan, CHEN Jianlin, GUAN Hongqiong. Department of Obstetrics, The Second Affiliated Hospital of Hainan Medical University, Haikou 570311, China

[Abstract] Objective To investigate the relationship between maternal-fetal LMP and HLA-DM gene sharing rate and the incidence of pregnancy-induced hypertension in Hainan. Methods A total of 60 mothers and fetuses with pregnancy-induced hypertension who gave birth in the obstetrics department of our hospital from August 2016 to August 2018 were selected. 200 pairs of healthy pregnant women and their fetuses who gave birth in our hospital during the same period were selected as the control group. Blood samples were collected from all subjects, and DNA from peripheral blood leukocytes was extracted. Then PCR amplification followed by gene sequencing. To compare the difference in the sharing rate of LMP and HLA-DM between cases with pregnancy-induced hypertension and healthy controls. Results When HLA-DM was shared by two, the proportion of hypertensive disease group during pregnancy was significantly higher than that of the controls (P<0.01). When the LMP was shared by 4, the proportion of hypertension in pregnancy was significantly higher than that of the controlse (P<0.01). The HLA-DMB* 0103 locus and LMP2-R/H gene sharing rate was the highest in the patients with hypertension in pregnancy, which was significantly different from the control group (P<0.05). There was no significant difference in the sharing rate of other sites (P>0.05). Conclusion The incidence of hypertension during pregnancy in Hainan may be related to sharing rate of LMP and HLA-DM genes among women with pregnancy-induced hypertension and their fetus in Hainan. Among them, HLA-DMB* 0103 and LMP2-R/H may be susceptible genes for pregnancy-induced hypertension.

[Key words] pregnancy-induced hypertension; LMP; HLA-DM; gene sharing rate

基金项目：海南省卫计委基金项目(1601320313A2001)

作者单位：570311海口，海南医学院第二附属医院产科(韩贞艳，关红琼)；中南大学湘雅二医院妇产科(陈建林)

通讯作者：陈建林(843213063@qq.com)

(收稿日期：2019-02-20)