近年来，由于工业化和城市化的快速发展，大量的重金属进入水体及其他环境系统中，长期存在于环境中，并通过食物、污水和空气等进入人体且不断蓄积，直接危害人体健康[1]。砷(As)、铅(Pb)、镉(Cd)、镍(Ni)是已知的有毒重金属，具有一定的生殖毒性，且能通过胎盘屏障[2, 3]。动物实验研究发现，砷、铅、镉、镍暴露会影响胚胎的正常发育及后代的生长[4, 5]。然而，其致畸作用的机制尚不清楚。
目前，越来越多的研究聚焦于环境暴露引起的表观遗传学改变[6]。表观遗传学是指在不改变DNA序列的前提下，基因表达发生的可遗传的变化，被认为是环境暴露和疾病发生发展之间的机制桥梁[7, 8]。其中，DNA甲基化是研究最广泛的机制之一，是指在DNA甲基转移酶(DNA Methyltransferase, DNMT)的催化下，将S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基添加到DNA分子上[9]。流行病学研究发现，母亲砷、铅、镉、镍暴露会引起胎儿脐带血中整体[10]及特异基因甲基化水平的改变，包括砷甲基转移酶基因(As3MT)[11]、印迹基因(H19、HSD11B2、PEG10、MEG3)[12, 13]、DNMT3B基因[14]等。但大部分研究采集母亲外周血、尿、指甲等生物标本进行重金属暴露测量，鲜有研究使用脐带组织测量重金属含量。脐带作为胎儿身体的一部分，测量其污染物浓度，能更好地评估胎儿体内污染物的真实暴露水平。为探讨一般人群中重金属含量与DNA甲基化水平的关系，本研究纳入173例无重大体表出生缺陷胎儿，测量其脐带组织砷、铅、镉、镍金属含量，及脐带血中DNMT3B基因甲基化水平，探索胎儿重金属内暴露对DNA甲基化水平的影响，为重金属的致畸作用机制研究提供依据。
对象及方法
一、研究对象
本研究为横断面研究。研究对象来自北京大学生育健康研究所于2003年1月至2016年12月在山西省太谷县、平定县、昔阳县、寿阳县、泽州县、太原市和长治市开展的病例对照研究。研究对象纳入标准为：(1)无重大体表出生缺陷的正常胎儿或新生儿；(2)母亲为山西省常住居民(在本地居住2年以上)，且本次妊娠期间在本地居住；(3)同意参加研究并签署书面知情同意书。本研究通过北京大学生物医学伦理委员会审批。
二、方法
1. 问卷调查及标本采集：对调查员进行统一规范的培训，在终止妊娠或分娩前后，采用结构式问卷对研究对象的母亲进行面对面调查。调查内容包括母亲基本人口学特征、生活方式、孕期饮食情况、环境污染物暴露情况等。胎儿娩出时，现场采集5～10 cm脐带组织、脐带血等标本，并用干冰转运至实验室。脐带组织保存在-20℃冰箱，脐带血以纸血片或血细胞方式分别保存于-20℃、-80℃冰箱。
2. 脐带组织重金属含量检测：分离2g左右的湿重脐带，用钛合金剪刀将脐带血管剪开，超纯水清洗后放入真空冷冻干燥机，冻干至约0.2g。在高压微波消解仪(Ultra WAVE, Milestone, Italy)中用3 mL硝酸溶液和0.5 mL双氧水消化冻干脐带。处理1h后，从石英消解管中取1ml样本加入到EP管中，超纯水稀释至2ml。使用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)检测并得到结果。每批次检测同时制备2份猪肝标准品(GBW 10051)，对每20个脐带样品进行质控。砷、铅、镉、镍的检出限分别0.011 ng/mL、0.002 ng/mL、0.001 ng/mL、0.016 ng/mL。所有样本的重金属含量均高于检出限。
3. 脐带血DNA提取：用DNA提取试剂盒(QIAamp DNA Mini Kit)，按照试剂盒说明书提取脐带血中的DNA，使用NanoDrop分光光度计对DNA样本的浓度及纯度进行测定，并置于-80°C冰箱保存。
4. 脐带血DNMT3B基因甲基化水平检测：选取DNMT3B基因甲基化岛区域为目标区域，使用EpiDesigner网站(http://www.epidesigner.com/)，在线设计PCR引物，PCR引物共覆盖24个CpG位点，剔除3个位点不可分析，共21个可分析位点。正向引物为5′-aggaagagag-GGGTTTTTAGGGGTTTTTTTTG-3′，反向引物为5′-agtaatacgactcactatagggagaaggct-CCCCTCCCACAAAATATATACAATA-3′。取500ng DNA样本使用试剂盒(EZ DNA Methylation kit，Zymo公司)进行重亚硫酸盐转换。处理后的DNA使用Sequenom MassARRAY时间飞行质谱阵列基因分析平台进行定量分析。先配置5μL体系进行PCR扩增，反应条件为：95℃ 4min; 95℃ 20s，58℃ 30s，72℃ 1min(45个循环)；72℃ 3min。之后使用虾碱性磷酸酶(SAP)纯化PCR产物，条件为37℃ 20min，85℃ 5min。使用T切割转录酶进行碱基特异性酶切反应(MassCLEAVE),条件为37℃ 3h。最终产物转移至384孔板，加入清洁树脂进行脱盐处理并上机检测。用EpiTYPER软件进行峰值检测及甲基化水平定量计算。甲基化数值用百分数表示，DNMT3B的甲基化水平为21个位点的平均值。实验中设置阳性对照和阴性对照进行质控。
5. 统计分析方法：砷、铅、镉、镍金属浓度用中位值及四分位间距表示，基因甲基化水平用
表示。采用Spearman等级相关法进行相关分析。对四种金属含量进行log对数转换，并采用多重线性回归模型调整混杂，分析四种重金属对DNMT3B甲基化水平的影响。混杂因素包括母亲分娩年龄、孕前BMI、文化程度、职业、围孕期叶酸补充情况、主动或被动吸烟暴露、胎儿孕周及胎儿性别。使用Stata 14.0 软件进行数据分析。双侧P<0.05为差异有统计学意义。
结 果
本研究共纳入173例无重大体表出生缺陷胎儿，均为汉族，男性和女性的比例分别为44.7%、55.3%，平均孕周为(39.8±3.0)周。接受问卷调查的母亲平均分娩年龄为(27.0±4.7)岁，孕前BMI为(23.0±3.6)kg/m2。113(65.3%)人文化程度为初中及以下。大部分人(77.3%)的职业为农民，89(53.0%)人为初产妇。其余孕期环境因素暴露特征见表1。
表1 母亲、胎儿基本人口学及孕期环境暴露因素特征
Table 1 Basic demographic characteristics and prenatal environmental exposure among mothers and infants
Characteristics∗ n(%)Age at delivery (mean±SD)27.0±4.7BMI (mean±SD)23.0±3.6Education level Junior school and lower113(65.3) High school and above60(34.7)Occupation Famer133(77.3) Other39(22.7)Han ethnicity173(100.0)Parity 189(53.0) ≥279(47.0)Folic acid supplementation Yes86(52.4) No78(47.6)Active or passive smoking Yes70(40.7) No102(59.3)Alcohol drinking Yes15(8.8) No156(91.2)Infant gender Male76(44.7) Female94(55.3)Gestational week (mean±SD)39.8±3.0
*The number for some variables data may not equal to total number due to missing value.
脐带组织中，砷、铅、镉、镍浓度的中位值及四分位间距分别为7.66(5.24～10.30) ng/g、23.91(16.74～44.29) ng/g、0.95(0.47～2.71) ng/g、21.42(15.61～32.2) ng/g。脐带血中DNMT3B基因平均甲基化水平为(7.38±2.66)%。Spearman等级相关法结果显示，镉与DNMT3B甲基化水平存在相关性(r=0.19， P=0.01)，其余金属与DNMT3B甲基化水平无相关性(P>0.05)。4种重金属的浓度均为偏态分布，进行log对数转换，分别绘制散点图。详见图1。
图1 脐带中砷、铅、镉、镍金属含量与DNMT3B甲基化水平散点图
Figure 1 Correlation between concentrations of As, Pb, Cd and Ni in umbilical cord and DNMT3B methylation level
以DNMT3B甲基化水平为因变量，各金属浓度的log转换值为自变量，调整混杂因素，进行多重线性回归分析。回归结果显示，脐带组织中镉含量对DNMT3B甲基化水平的影响有统计学意义(β=0.74, P=0.03)。其余金属对DNMT3B甲基化水平无显著影响(P>0.05)。详见表2。
表2 脐带中砷、铅、镉、镍金属对DNMT3B甲基化水平的影响
Table 2 Effect of umbilical cord As, Pb, Cd and Ni on DNMT3B methylation level
MetalsβSE95% CIArsenic 0.330.53-0.71, 1.37Lead 0.010.65-1.28, 1.30Cadmium 0.740.34 0.06, 1.42∗Nickel-0.650.75-2.13, 0.83
*P<0.05
多重线性回归模型中分别加入镉与砷、铅、镍金属两两配对的交互项，结果显示镉与砷、铅、镍金属对DNMT3B甲基化的影响均无显著交互作用(P>0.05)。详见表3。
表3 脐带中重金属交互作用对DNMT3B甲基化水平的影响
Table 3 Interaction effect among umbilical cord As, Pb, Cd and Ni on DNMT3B methylation level
MetalsβSE95% CICadmium×Arsenic-1.220.94-3.08, 1.86Cadmium×Lead-2.031.10-4.21, 0.15Cadmium×Nickel 0.361.30-2.20, 2.93
讨 论
本研究为横断面研究，以无重大体表出生缺陷的胎儿为研究对象，分析一般人群中重金属暴露对胎儿DNA甲基化水平的影响。结果显示，控制混杂因素后，脐带组织镉含量增加，会引起脐带血中DNMT3B甲基化水平升高。未发现镉与砷、铅或镍对DNMT3B甲基化水平的交互作用。
砷、铅、镉、镍是生产生活环境中普遍存在的污染物，可以通过多种途径进入人体，如呼吸系统、消化系统等，对人类健康造成了很多不良影响[1]。有研究报道，砷、铅、镉、镍可以通过胎盘屏障，形成宫内暴露，引起不良妊娠结局[2,3]。本研究检测了173例胎儿脐带组织中砷、铅、镉、镍的含量，其中，铅、镉含量的中位值分别为23.91 ng/g、0.95 ng/g，略低于日本的一项人群研究报道的39.9 ng/g、1.16 ng/g[15]。既往研究多采用脐带血清样本检测砷含量，一项在中国人群开展的大型队列研究(N=3474)报道脐带血清砷含量中位值为1.87 μg/L[16]。与脐带血相比，脐带组织是胎儿组织的一部分，更能反映胎儿的暴露情况。本研究首次使用脐带组织检测砷的中位值为7.66 ng/g。本研究也首次报道了脐带组织中镍的含量，其中位值为21.42 ng/g。
已有研究发现，母亲孕期砷、铅、镉、镍暴露会影响胎儿的DNA甲基化水平。本研究以DNMT3B基因为目的基因，检测甲基化水平并分析与重金属的关系。DNMT3B基因是DNA甲基转移酶(DNMT)家族的成员之一，其编码的蛋白酶在合成甲基化(de novo methylation)过程中起重要作用[17]。对169例居住在镉暴露区和100例非暴露区的泰国居民的尿镉浓度检测发现随着尿镉浓度增加，外周血DNMT3B甲基化的水平越高[14]。另一项对202名阿根廷妇女的研究发现低水平的尿镉暴露(0.23 μg/L)与外周血DNMT3B基因表达呈负相关[18]。以上研究提示镉暴露会影响DNMT3B甲基化及表达水平，但暴露测量均使用妊娠妇女尿液标本，不能反映胎儿生长发育过程中的真实暴露情况。本研究中，多重线性回归分析发现，控制混杂因素后，DNMT3B甲基化与脐带镉含量呈正相关，随着镉暴露水平的增加，DNMT3B甲基化水平升高，提示表观遗传改变可能是重金属致病的重要途径之一。
本研究还探讨了镉与砷、铅和镍金属之间的交互作用。结果显示，镉与其他三种金属对DNMT3B甲基化水平的影响均无统计学交互作用。目前有关金属交互作用的研究较少，一项母亲镉、砷暴露与后代先天性心脏病发病风险关联研究中发现，镉和砷对先天性心脏病发病风险存在交互作用[19]。然而，其相互作用的生物机制尚不清楚。
本研究的优势在于，相比以往研究，使用脐带组织测量胎儿发育过程中的重金属内暴露。使用脐带血测量DNA甲基化水平，DNA甲基化能作为一种生物标志物，可运用临床上异常状态的早期识别和诊断。
综上所述，本研究发现胎儿脐带组织重金属暴露可能会影响DNMT3B基因甲基化水平，为今后进一步探究重金属与疾病关联的作用机制提供依据。此外，胎盘对重金属缺乏有效屏障作用，为减少胎儿的宫内暴露剂量，应采取有效防护措施、开展合理的孕期健康教育，避免孕妇暴露于环境重金属污染。
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