多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是育龄女性不孕最常见的病因之一，主要的临床特征为月经稀发、肥胖、多毛、痤疮和不孕等[1]。血清抗苗勒氏管激素(anti-Mullerian hormone，AMH)高水平与PCOS具有高度的一致性，但难以用统一的AMH截断值来作为诊断PCOS的金标准[2]。在体外受精/卵胞浆内单精子注射-移植(IVF/ICSI-ET)中，由于拮抗剂方案相对于传统长方案并发症发生率较低，且对患者更方便，已成为PCOS患者的一线治疗方案[3]。目前，国内关于PCOS不孕症患者血清AMH水平和拮抗剂方案相关的研究较少。本文将进一步分析PCOS患者AMH水平与其一般临床特征的关系，并通过研究拮抗剂方案中PCOS患者卵巢反应性、评估IVF/ICSI助孕结局，进而指导PCOS患者治疗前的遗传咨询。
资料与方法
1.一般资料：回顾性分析2016年1月至2019年1月在哈医大一院生殖中心进行第一周期IVF治疗的116例PCOS不孕症患者，患者均符合2003年的鹿特丹会议标准[4]。孕龄女性血清AMH的正常参考范围为1.1～10 ng/mL。本研究以PCOS患者为研究对象，血清AMH均处于较高水平。根据AMH水平将其分组，其中AMH≥10 ng/mL界定为高AMH组，共67人，平均年龄(30.1±3.8)岁；AMH<10 ng/mL为中低AMH组，共49人，平均年龄(29.9±3.8)岁，两组在年龄上差异无统计学意义。排除标准为(1)年龄<18岁或者年龄>40岁；(2)卵巢或者子宫有过手术史；(3)子宫内膜异位症；(4)子宫内膜息肉；(5)子宫肌瘤等。
2.方法：进周期前采集静脉血4 mL，血液样本离心后取上层清液待测，血清AMH水平用ELISA法测定。月经第2～4天查性激素基础水平及经阴道超声，如无性激素水平明显异常及优势卵泡，则根据年龄和体重指数使用促卵泡激素(follicle stimulating hormone,FSH)，再根据卵泡大小和血清黄体生成素(luteinizing hormone,LH)水平添加拮抗剂，一般选择主导卵泡直径达14 mm或者LH≥10 IU/L时添加，在卵泡发育中晚期，当LH≤11 IU/L或高龄时可考虑加用基因重组LH(rLH)75～150 IU/日。当主导卵泡有2个或3个直径达到18 mm以上，注射绒促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)10 000 IU,或hCG 4 000 IU加促性腺激素释放激素类似物(gonadotrophin releasing hormone analogue，GnRH-a)0.2 mg，35～36 h后经阴道穿刺取卵，满足移植条件者3～5 d后进行鲜胚移植(移植胚胎数≤2个)，不能新鲜移植者进行全胚冷冻，月经复潮后择期进入人工周期，进行冻胚移植(移植胚胎数≤2个)。移植后14 d、30 d进行相关检查确定是否存在生化妊娠及临床妊娠，主要检查临床项目为血hCG和妇科超声。
3.统计学处理：运用SPSS 23.00统计软件处理数据。计量资料用均数±标准差表示，两组间比较采用t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。二元正态资料的相关性分析采用Pearson法。P<0.05表示差异有统计学意义。
OHSS高风险发生率=hCG日血清E>5 000 U/L或者取卵数≥15或自觉腹胀或卵巢直径大于5 cm的周期数/总周期数×100%
2PN受精率=2PN受精数/获卵数×100%
2PN卵裂率=2PN受精卵裂胚胎数/受精卵数×100%
优胚率=Ⅰ级+Ⅱ级的胚胎数/受精卵总数×100%
新鲜周期取消率(%)=新鲜周期取消周期数/总周期数×100%
β-hCG阳性率=β-hCG阳性周期数/移植周期数×100%
临床妊娠率=B超下可见胎心胎芽的周期数/移植周期数×100%
种植率=B超下宫内和宫外的总孕囊数/移植胚胎总数×100%
结果
1.中低AMH组和高AMH组一般临床特征的比较:高AMH组的窦卵泡计数(AFC)、睾酮(T)、基础垂体生成素(bLH)明显高于中低AMH组(P<0.05)，两组间体重指数(BMI)、基础雌二醇(bE2)、基础卵泡刺激素(bFSH)差异无统计学意义，见表1。
表1 中低AMH组和高AMH组的一般临床特征的比较
组别例数AFCBMI(kg/m2)T(ng/mL)bE2(pg/mL)bLH(U/L)bFSH(U/L)中低AMH组4917.71±5.4625.18±3.310.37±0.1329.73±14.185.38±3.224.83±1.26高ANH组6723.09±7.25∗24.12±2.990.45±0.15∗32.10±10.747.01±3.45∗4.93±1.09
注：与中低AMH组比较，*P<0.05
2.中低AMH组和高AMH组促排情况比较:高AMH组Gn用量显著低于中低AMH组(P<0.05)，两组间的Gn天数、扳机日E2水平、获卵数、优质卵泡数差异均无统计学意义，见表2。
表2 中低AMH组和高AMH组促排情况比较
组别例数Gn天数Gn用量扳机日E2(pg/mL)获卵数优质卵泡数中低AMH组4910.73±2.382217.3±575.633744.90±1936.7016.14±7.1513.78±5.87高AMH组6710.84±2.141897.81±618.48∗4085.75±1739.6616.06±7.8513.96±7.78
注：与中低AMH组比较，*P<0.05
3.中低AMH组和高AMH组受精及胚胎情况的比较: 与中低AMH组相比，高AMH组的2PN受精率、2PN卵裂率、优质胚胎数略有下降，但差异均无统计学意义；高AMH组的优胚率显著降低(P<0.001)，见表3。
表3 中低AMH组和高AMH组受精及胚胎情况比较
组别例数2PN受精数获卵数受精率(%)受精卵裂胚胎数受精卵数卵裂率(%)平均优质胚胎数优胚优胚数胚胎总数优胚率(%)中低AMH组4950479163.7249156986.295.55±4.7827256947.80高AMH组67682107663.3867578386.205.43±4.5423178329.50∗
注：与中低AMH组比较，*P<0.05
4.PCOS患者血清AMH水平及优胚率的关联性分析：使用Pearson对所有PCOS患者血清AMH水平及优胚率进行相关性分析，结果显示两者呈负相关(r=-0.377,P<0.001)。
5.中低AMH组和高AMH组在拮抗剂方案中的妊娠结局差异：中低AMH组有17例新鲜移植，有32例因为不满足新鲜移植条件而进行冻胚移植，其中有23例因为有卵巢过度刺激(ovarian hyperstimulation syndrome,OHSS)倾向而取消新鲜移植，进行冻胚移植。高AMH组67例中有12例进行新鲜移植，有55例因不满足新鲜移植条件而进行冻胚移植，其中有44例是因有OHSS倾向而取消新鲜周期移植。
与中低AMH组相比，高AMH组OHSS高风险发生率显著增加(P=0.001),新鲜周期移植率显著下降(P=0.039)。在新鲜周期或冷冻周期，高AMH组和中低AMH组的β-HCG阳性率、临床妊娠率及种植率差异均无统计学意义，见表4。
表4 新鲜或冻融周期两组的β-HCG阳性率、临床妊娠率、种植率比较
组别新鲜周期周期数OHSS高风险发生未发生发生率(%)新鲜周期取消移植取消率(%)移植胚胎数β-hCG阳性阴性阳性率(%)临床妊娠阳性阴性妊娠率(%)中低AMH组49232646.94321765.312.00±0.0011664.7110758.23高AMH组67511676.11∗551282.09∗2.00±0.008466.666650组别新鲜周期移植胚胎总数种植孕囊数未见孕囊数率(%)冷冻周期周期数平均移植胚胎数β-hCG阳性阴性率(%)临床妊娠阳性阴性率(%)种植阳性阴性率(%)中低AMH组34142041.18322.00±0.0025778.1224875451970.31高AMH组2471729.16551.96±0.19451081.82401572.73614756.48
注：与中低AMH组比较，*P<0.05
讨论
AMH由未发育的卵泡产生，包括初级、窦前卵泡和直径2～6 mm的窦卵泡。与卵巢呈正常结构的人相比，卵巢呈多囊结构的女性分泌AMH更多[4]。PCOS患者AMH产生过量可能对AMH/AMHR2基因变异等遗传因素有关[5]。AMH的异常增加降低了芳香化酶的表达和卵泡对FSH的敏感性，导致无排卵和高雄激素血症，高雄正反馈于颗粒细胞使其分泌AMH增加，最终导致卵泡发育障碍的恶性循环[6]。在本研究中，高AMH组AFC、睾酮、基础LH明显高于中低AMH组，这与上述结论一致。本研究中，两组的BMI差异没有统计学意义，这与国外同类型研究[2]存在相似性。然而在一项以肥胖型PCOS患者为研究对象的国外研究[7]中表明，肥胖型PCOS患者的血清AMH水平会随着BMI的降低而有所下降。近年来，国内外学者提出，肥胖型患者通过减重而改善了卵巢的排卵情况，血清AMH水平随之下降，而单纯的体重增减对AMH影响不大。
拮抗剂方案能够在获得较为满意的妊娠结局的同时简化就医流程，减少促性腺激素(gonadotrophin,Gn)用量、降低新鲜周期取消率，更能降低OHSS的发生率[2]。拮抗剂方案能有效降低OHSS发生率可能的原因是(1)GnRH拮抗剂能减少颗粒细胞血管内皮生长因子的表达，降低血管通透性[8]；(2)与长方案相比，使用拮抗剂方案时患者卵泡发育同步性较差，FSH阈值低的优先发育成优势卵泡，最终使获卵数减少；(3)相对于长方案，使用拮抗剂方案促排时FSH刺激时间缩短；(4)拮抗剂方案可以用GnRH激动剂扳机，减少了hCG的使用。Trenkic′等[9]在一项前瞻性研究中发现，PCOS患者使用拮抗剂方案的妊娠率与传统长方案相当。在本研究中PCOS高AMH组和中低组OHSS高风险发生率均较高，且高AMH组的OHSS发生率明显高于中低AMH组。提示对于PCOS患者，尤其合并高AMH时，应首选拮抗剂方案促排卵。
AFC对卵巢高反应具有较高的预测价值[10]。在本研究中，PCOS患者中高AMH组AFC明显高于中低AMH组，但两组获卵数和优卵数没有差异，高AMH组的优质胚胎率显著低于中低AMH组。对所有PCOS患者的AMH水平与优质胚胎率进行回归性分析进一步提示PCOS患者血清AMH水平越高，优质胚胎率反而降低。这与近年相关文献[11]关于过高的AMH水平会降低PCOS患者的优胚率的观点一致。考虑可能的原因是(1)高AMH组的垂体激素明显升高，致其对外源性的Gn反应性降低，最终影响了卵母细胞的成熟；(2)AMH抑制FSH诱导的颗粒细胞芳香化酶表达，降低睾酮向雌二醇的转化，影响了卵母细胞胞质及胞核的同步成熟。目前，高水平AMH对优胚率的影响机制尚不明确，无直接证据证明AMH水平升高会致优胚率下降。由于本研究的样本量较少，关于PCOS患者血清AMH水平与优质胚胎率的关系尚待进一步的研究。
虽然本研究中高AMH组的优质胚胎率明显低于中低AMH组，但在新鲜移植周期及冷冻移植周期中两组的妊娠率均无明显差异。考虑原因是PCOS患者总体获卵数较多，形成优质胚胎数较多，第一周期新鲜或冷冻移植均有质量较好的可利用胚胎，从而获得较好的临床妊娠结局。
综上所述，PCOS不孕症患者的血清AMH水平与其临床特征密切相关，在拮抗剂方案助孕中，AMH高水平预示着发生OHSS的风险增加，优胚率下降，但AMH水平尚不能预测PCOS患者在新鲜或冷冻周期中的妊娠结局。
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