·综述·
自Mullis于1985年首次发明PCR技术以来，PCR技术已经在临床诊断中得到广泛应用，现已衍生出数十种PCR技术，如原位PCR、实时荧光定量PCR、数字PCR(digital PCR，dPCR)等[1-2]。dPCR属于第三代PCR技术，自20世纪末提出以来，作为一种绝对定量分析技术在生物标志物检测、临床诊断等方面表现出巨大的应用潜力，引起生物、医学等领域的高度重视并得以迅速发展[3-5]。随着dPCR技术不断改进和完善，其应用范围也进一步拓展，目前该技术主要应用于癌细胞突变位点、病原微生物及食品成分分析等相关领域的检测[3,6-7]。与传统PCR技术相比较，dPCR不依赖标准曲线和标准品，可直接检测样品中核酸的原始浓度，且技术灵敏度更高、耐受性更强，并且快速简单、价格低廉[8]。按照分液技术的不同，目前dPCR主要分为三种：以孔板为载体的微孔板数字PCR、以“油包水”微滴为特点的微滴式数字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)和以芯片为反应仓的微流控芯片数字PCR。其中，ddPCR利用油包水乳化微滴颗粒作为反应器进行检测，其研究和应用最为广泛[9]。
产前诊断(prenatal diagnosis)是运用各种技术手段，在出生前对胚胎或胎儿的发育状态、是否患有疾病等方面进行检测诊断，对可治性疾病可选择适当时机行宫内治疗；不可治疗的疾病做到知情选择[10]。目前ddPCR技术已开始应用于产前诊断领域，本文就ddPCR技术在产前诊断中的应用进展进行综述。
ddPCR是将总反应体系分为2万个独立的PCR反应单元，每个反应单元为体积相近的纳升级微滴，微滴为“油包水”的结构，每个微滴包含或者不包含1个或多个拷贝的靶分子，经单分子模板PCR扩增后，利用探针上的特异性荧光信号对每个微滴逐一检测，其中包含靶分子的微滴荧光信号为阳性，不包含靶分子的微滴荧光信号为阴性[11]，根据泊松分布的原理，由检测的荧光信号阳性及阴性的微滴数，即可计算出样本中的靶分子数[4,7]。利用统计学方法计算原始样本中靶基因的拷贝数。
与荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)及其他分子诊断技术相比，ddPCR在灵敏度、绝对定量、耐受性等方面具有一定的优势[12]。
1.高灵敏度：ddPCR技术把不同DNA模板分隔在2万个油包水小微滴中，每个微滴独立检测目的序列，大大提高了检测的灵敏度。在无创产前领域可准确检测孕妇外周血血浆胎儿的游离核酸(cell-free DNA，cffDNA)含量仅为2%甚至更低的样本，其检测下限明显优于qPCR等检测技术[13-14]。
2.绝对定量：该技术通过泊松分布原理，可以由公式λ= - ln(1- k/ n)计算出靶分子的起始浓度，其中k为阳性微滴数，n为微滴总数，λ为平均微滴数[15]。与qPCR相比，ddPCR通过终点测量收集荧光信号，其结果不依赖于Ct值和标准曲线，有效地避免了因起始浓度低而造成检测结果准确性较差的缺陷[8]。
3.高耐受性：对血液、组织、羊水等样本进行检测时，在相应的PCR反应体系中，可能会存在扩增反应的抑制剂、母源性基因序列以及其他因素的干扰，一定程度上会对检测结果的准确性造成影响。ddPCR技术微滴化的过程中，干扰因素和靶分子均匀的分配到每个反应单元，从而显著降低了干扰因素的影响，同时又以终点信号的有无为判断依据，不受扩增效率的限制，有效地提高了对干扰因素的耐受能力[5]。
此外，与其他分子诊断技术相比，ddPCR还具有重复性强、检测周期短、价格低廉等优势[16]，这些优点使得ddPCR能够在产前诊断中得到很好的应用。
据2012年卫生部发布的官方数据，中国出生缺陷发生率在5.6%左右，每年新增出生缺陷数高达90万例[17]，给家庭和社会带来巨大的精神和经济负担，开展产前筛查与诊断，及早发现严重致残或致死性异常是防止出生缺陷发生的重要措施。随着分子遗传学的发展，产前诊断技术不断朝着快速、准确、高灵敏度、无创伤的方向发展。
1.胎儿染色体非整倍体的产前检测：21-三体综合征又称为唐氏综合征，是一种常见的染色体非整倍体疾病，活产新生儿的发病率为1/600～1/800，患儿通常表现为特殊面容，智力障碍，生长发育迟缓和肌张力减退等[18]。目前临床上通常联合孕妇年龄、超声学检查和血清学检查进行21-三体综合征产前筛查，但该方法存在一定的假阴性率和较高的假阳性率[19-20]。1997年Ioan等[21]在孕妇外周血中检测到Y染色体上特异性DNA序列，证实孕妇外周血中存在胎儿游离核酸，这一发现为无创产前检测奠定了基础。无创产前检测技术(non-invasive prenatal testing，NIPT)就是利用孕妇外周血胎儿游离DNA对胎儿的某些遗传信息进行检测，是一种无创操作，避免了有创操作带来的不良妊娠风险。近年来，随着高通量测序技术(next-generation sequencing，NGS)的发展，无创产前检测日益完善，并在孕妇染色体非整倍体疾病、单基因遗传病等方面广泛应用[22]。但是NGS成本较高、操作复杂、检验周期长、数据解读困难，给疾病检测带来一定的困难，而ddPCR在痕量样本、低频突变、拷贝数变异等检测上的准确性、灵敏性和稳定性，使其在cffDNA的检测上具有一定的优势[23]。
Allach等[15]人应用ddPCR，设计出一种通过检测孕妇外周血血浆中游离核酸(cell-free DNA，cfDNA)中胎儿游离核酸(cell-free fetal DNA，cffDNA)的含量来鉴别胎儿是否为染色体非整倍体的方法，并对213例孕妇血浆DNA进行了验证实验，利用一组针对21号染色体和参照染色体(1号染色体)的水解探针，对孕妇血浆中cffDNA进行分子计数。实验结果证实，即使样本中目的基因的含量低至5%，ddPCR技术依然可以准确的区分21-三体组和正常组。Lee等[24]人用157例阴性样本和三个T21阳性孕妇的四种不同来源的DNA样本(羊水、细胞系、全血和孕妇血浆)作为标准，以此确定高风险的阈值，进而对877例孕妇的血浆样本行ddPCR的检测，再利用金标准(羊膜腔穿刺等)对每例孕妇行产前诊断。通过比较，ddPCR检测的准确率高达99.66%。
以上研究表明，具备灵敏度高、简便易行、检测周期短等优点的ddPCR技术，有望成为一种产前检测21-三体的新选择，值得在临床上推广[15,20,24-25]。
2.单基因遗传病产前检测中的应用：ddPCR技术在单基因遗传病检测方面尚处于起步阶段，邹洋等[16]运用ddPCR技术对56个脊肌萎缩症(spinal muscular atrophy，SMA)家系共138例样本(其中121例外周血样本，13例羊水样本，2例脐带血样本，2例绒膜绒毛样本)行SMN1基因第7外显子拷贝数检测，其结果与多重连接依赖性探针扩增技术(multiplex ligation dependent probe amplification，MLPA)——目前国际推荐临床应用的SMN1基因第7外显子拷贝数变异的检测技术——检测的结果一致，为SMA临床基因检测和产前诊断提供了新方法。
徐佩文等[26]应用ddPCR技术对一白化病家系和苯丙酮尿症家系孕妇进行无创产前检测，通过检测孕妇外周血浆cffDNA以确定胎儿是否遗传了父亲的致病基因突变位点，结果显示ddPCR技术检测结果与羊水DNA Sanger测序结果一致。Emmanuel等[27]应用ddPCR技术对1例囊性纤维化高风险的家系进行无创产前检测结果显示胎儿携带父源性突变位点，不能排除子代患囊性纤维化的可能，须进一步行有创产前诊断，检测是否携带母源性突变位点。
Camunas-Soler等[28]利用ddPCR技术检测cffDNA的方法，设计了一套针对单基因遗传病的无创产前检测技术，并用之检测9名有生育单基因疾病患儿风险的孕妇血液样本，所涉及的疾病包括血友病、囊性纤维化、鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症、β-地中海贫血、甲羟戊酸激酶缺乏症、乙酰胆碱受体缺乏症和非综合征型耳聋等。结果显示2例阳性7例阴性，由新生儿测试予以证实，该技术在孕11周且胎儿DNA含量仅为3.7%时即可检测成功。
孙艺佳等[29]应用ddPCR技术建立了一种检测母体血浆cffDNA中父源CD41-42基因突变的β-地中海贫血的方法，适用于夫妇为非同型β-地中海贫血基因突变携带者，排除父源CD41-42基因突变的无创产前检测，并对20例孕妇血浆样本进行检测，结果与确诊结果完全相符。
综上，对于父源性致病基因突变的单基因遗传病，可采用ddPCR技术对胎儿是否携带致病基因行无创产前检测，在不排除是否携带母源性致病基因的前提下，可有效避免有创产前诊断。
3.在鉴定胎儿性别和血型中的应用：Rh血型系统是临床输血医学最复杂最重要的系统之一，有D、E、C、c、e五种抗原，其中D抗原免疫原性最强，临床上将缺乏D抗原者成为Rh阴性[30]。Rh阴性妇女怀有D抗原阳性胎儿，可产生初次免疫，再次怀有D抗原阳性胎儿时会造成新生儿溶血病，胎儿期即可出现严重溶血、贫血全身水肿，甚至死胎。因Rh阴性血型稀少，对孕产妇产后出血等危急情况的输血治疗带来很大的难度。如何早期对Rh阴性孕妇进行产前诊断，对防治Rh血型引发的新生儿溶血病具有重要的意义[30-31]。
Madgett等[13]用ddPCR和qPCR两种方法对46例RhD阴性孕妇的血液样本行产前诊断，以RhD基因第5外显子(RhD5)为靶片段时，ddPCR(100%)的灵敏度明显高于qPCR(83%)。而且针对cffDNA含量低于2%的样本，ddPCR的灵敏度均为100%，qPCR却无法达到相同的水平。
某些伴性遗传疾病的发生与胎儿性别密切相关，如杜氏肌营养不良、血友病等，为降低后代患病风险，对已明确携带相关致病基因的夫妇可在孕期进行胎儿性别鉴定，或直接行胚胎植入前遗传学检测(preimplantation genetic testing,PGT)。D′Aversa等[14]采用ddPCR技术对29例孕早期的孕妇血浆中cffDNA行胎儿性别鉴定，结果显示ddPCR可准确的检测出全部孕妇血浆中SRY基因靶点，表明ddPCR是一种灵敏、可靠的胎儿性别鉴定技术。
4.在其他相关领域的应用：qPCR具有检测成本低廉、操作便捷且结果准确等优点，是目前最常用的核酸检测技术。耿娟等[32]采用ddPCR技术和短串联重复序列的qPCR技术，分别检测40组产前诊断标本母体细胞污染情况，比较两种方法结果的准确性和灵敏度，ddPCR技术(≥1.56%)明显优于qPCR技术(≥6.25%)。
ddPCR技术作为一项新型生物检测技术，在无创产前检测中，发挥其在低含量核酸样本检测高灵敏度的优势，具有十分重要的临床意义和应用价值[5,33]。当然，ddPCR在临床应用上还存在诸多局限性，如对整倍体变异、染色体平衡易位、基因倒位或大片段缺失等检测的准确性还有待提高[34-35]。但随着应用研究的逐步深入和完善，ddPCR已被越来越多的科研工作者所熟知和使用，其适用范围会进一步扩展，检测的准确性、时效性和廉价性也会逐步提高，进而在产前诊断中发挥更大的作用。
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