小于胎龄儿(small for gestational age,SGA)是指出生体重低于同胎龄出生体重第10百分位数或2个标准差的活产儿，发生率约为8%～13%[1]。与适于胎龄儿(appropriate for gestational age infant,AGA)相比，SGA的围产期患病率和死亡率较高，儿童期发生营养不良、认知行为异常以及成年后罹患高血压、糖尿病等心脑血管和代谢性疾病的风险增加[2]。血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)是胎盘血管生长发育的关键调节因子，可促进血管内皮细胞增殖、迁移及活化[3-4]，已有研究证实SGA胎盘VEGFA表达降低[5]。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)对基因表达和功能可产生着重要影响，VEGFA基因变异或可通过改变VEGFA基因表达或VEGFA分泌影响胎盘血管生成导致SGA的发生。然而，目前相关研究较为少见。本研究采用巢式病例-对照研究设计探讨了VEGFA基因多态性与SGA易感性的关联。
对象与方法
1.研究对象：研究对象均来自马鞍山优生优育队列，该队列纳入了于2013年5月到2014年9月在马鞍山妇幼保健院建册并计划在该院分娩的孕妇共3 474例。在队列的单胎活产中共筛选出318例分娩SGA且无妊娠并发症(高血压或糖尿病)的母亲，按照1:1.5随机选取477例分娩AGA且无妊娠并发症的母亲作为AGA组，但仅有183例SGA母亲和298例AGA母亲提供了静脉血样本。因此，本研究共纳入481例孕妇，其中SGA组183例，AGA组298例。本项目已通过安徽医科大学生物医学伦理委员会审查(批号：20170283)。所有研究对象均签署知情同意书。
2.诊断标准：SGA为出生体重低于同胎龄婴儿平均体重的第10百分位的婴儿，AGA为出生体重位于同胎龄婴儿平均体重的第10百分位至第90百分位的婴儿[6]。
3.问卷调查：包括母亲年龄、文化程度、吸烟、饮酒、家庭月收入、母亲孕前体重指数(body mass index,BMI)和父亲BMI等。
4. SNP的选择及基因分型：使用QIAamp DNA Investigator试剂盒提取静脉血DNA。基于NCBI官方网站采用以下步骤筛选VEGFA基因上的潜在功能性SNP位点。首先，筛选位于3′UTR、5′UTR或编码区的错义突变、移码突变；然后，选择其中在中国汉族人群中的最小等位基因频率(minor allele frequency,MAF)≥ 0.1的位点；最后，进行连锁不平衡检验，保留高度连锁(r2≥0.8)位点中的一个进行研究。最终纳入7个SNPs(rs2010963、rs833061、rs10434、rs1570360、rs3025020、rs3025040、rs3025053)。使用上海天昊生物科技有限公司的imLDRTM多重SNP分型试剂盒进行基因分型，ABI3730XL分析仪进行测序，GeneMapper 4.1软件(Applied Biosystems,USA)分析基因型。为保证基因分型的准确性，对5%的样本实施双盲检测。
5.统计学处理：采用SPSS 23.0软件进行统计分析。计数资料用
表示；分类资料用率/构成比表示。采用Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验样本是否有群体代表性。采用χ2检验比较SGA组和AGA组人口学特征和VEGFA基因型的分布差异。采用多因素Logistic回归法分析在不同遗传模型下各位点与SGA发病风险之间的相关性。使用Benjamini-Hochberg法对Logistic回归分析的P值进行错误发现率(false discovery rate，FDR)校正。采用Power 3.0软件计算把握度。以P<0.05为差异有统计学意义。
结果
1.研究对象一般情况：如表1所示，两组研究对象在母亲年龄、文化程度、吸烟、饮酒、家庭月收入和父亲BMI的分布差异均无统计学意义。但是SGA组母亲孕前BMI显著低于AGA组，差异有统计学意义。
表1 481例研究对象的基本特征
人口学特征AGA组SGA组母亲年龄(岁)25.9±2.826.0±3.3BMI(kg/m2) 母亲孕前19.9±2.419.4±2.3∗ 父亲23.3±3.023.0±3.4文化程度[n(%)] 小学及以下47(15.3)36(19.6) 初中76(25.3)35(19.1) 高中104(34.7)55(30.1) 大学及以上73(24.7)57(31.2)家庭人均月收入[元,n(%)] <1 0003(1.0)2(1.1) 1 000≤～≤2 50068(22.7)39(21.3) 2 500<～≤4 000127(42.3)83(45.4) >4 000102(34.0)59(32.2)吸烟[n(%)] 从不284(94.7)178(97.3) 之前/现在16(5.3)5(2.7)饮酒[n(%)] 从不275(91.7)172(94.0) 偶尔/经常25(8.3)11(6.0)
与AGA组比较，*P<0.05
2.VEGFA基因多态性与SGA易感性的关联分析：除VEGFA rs3025053外，其余位点基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，纳入后续分析。如表2所示，rs2010963位点的CC、GC和GG基因型在SGA组和AGA组的分布差异具有统计学意义。其他位点在两组之间的基因型分布差异无统计学意义。调整母亲年龄、文化程度、吸烟、饮酒、家庭月收入后，与携带rs2010963 CC基因型孕妇相比，携带GC基因型的孕妇分娩SGA的风险显著增加(共显性模型：OR=1.94，95% CI=1.12～3.35)；携带GC/GG基因型的孕妇分娩SGA的风险也显著增加(显性模型：OR=1.69，95% CI=1.01～2.83)。敏感性分析进一步校正母亲孕前BMI和父亲BMI后，结果仍有显著性(显性模型：OR=1.75，95% CI=1.03～2.98)。但是，经FDR校正后rs2010963变异与SGA易感性关联的显著性消失(P=0.222)。基于1000 Genome database(https://www.internationalgenome.org/)公共数据库查询到rs2010963位点在中国汉族人群中的MAF为0.440。随后根据Power 3.0计算[7]，对于rs2010963位点在中国汉族人群中的MAF为0.440，在α=0.05 的检验水平下，SGA发病率为10%时，本研究的样本量有78%把握度能检验出OR=1.7的关联性。未发现其他5个SNP位点与SGA发生风险之间有显著关联性。
讨论
VEGFA基因位于染色体6p21.3，其编码蛋白是一种强有力的血管内皮生成因子,可影响血管通透性，调节早期胎盘血管的发育[3]。本研究结果提示，孕妇携带VEGFA rs2010963 G等位基因可能会增加分娩SGA的风险。之前有一项基于澳大利亚和新西兰人群的研究探讨了VEGFA rs699947和rs3025039与SGA关联性，没有发现其与SGA相关[5]。本研究在中国汉族人群中也没有发现与VEGFA rs3025039高度连锁的rs3025040与SGA显著相关。
目前虽然没有发现VEGFA rs2010963与SGA易感性的报道，但国内外关于VEGFA rs2010963与低出生体重和子痫前期的研究已较多。BanyaszI等[8]在128例低出生体重儿和200例健康足月儿中开展的巢式病例对照研究，结果显示VEGFA rs2010963 C等位基因增加了婴儿低出生体重的发生风险。这与本研究发现G等位基因会增加SGA的发生风险是相反的。VEGFA rs2010963多态性对子痫前期的影响在不同研究间也存在不一致性。在中国[9]和匈牙利[10]人群中，携带rs2010963 G等位基因的母亲对子痫前期的易感性降低，但在菲律宾[11]和突尼斯[12]人群中发现该等位基因与子痫前期无显著关联。遗传背景的种族差异可能是导致不同研究结果的重要因素。rs2010963的G等位基因在中国人群、欧洲人群和美国人群的频率分别为0.596、0.720和0.628。此外，环境因素没有被充分考虑和控制也可能是各研究结果不一致的原因。
表2 VEGFA位点多态性与SGA易感性的多因素Logistic回归模型分析
位点及基因型AGA组SGA组ORa (95% CI)ORb(95% CI)ORc(95% CI)rs833061 CC/CT/TT(孕妇数)23/107/16814/74/95——— 隐性模型[n(%)]168(56.4)95(51.9)0.84(0.58～1.21)0.84(0.57～1.22)0.80(0.55～1.18) 显性模型[n(%)]275(92.3)169(92.4)1.01(0.51～2.02)1.05(0.52～2.13)1.06(0.52～2.16)rs2010963 CC/GC/GG(孕妇数)63/123/11225/95/63——— 隐性模型[n(%)]112(37.6)63(34.4)0.87(0.59～1.28)0.85(0.57～1.26)0.85(0.57～1.26) 显性模型[n(%)]235(78.9)158(86.3)1.69(1.02～2.81)1.69(1.01～2.83)1.75(1.03～2.98)rs10434 AA/GA/GG(孕妇数)22/102/17411/65/107——— 隐性模型[n(%)]174(58.4)107(58.5)1.00(0.69～1.46)1.01(0.69～1.47)1.02(0.69～1.51) 显性模型[n(%)]276(92.6)172(94.0)1.25(0.59～2.63)1.25(0.59～2.67)1.22(0.57～2.64)rs1570360 AA/GA/GG(孕妇数)5/79/2146/56/121——— 隐性模型[n(%)]214(71.8)121(66.1)0.77(0.52～1.14)0.78(0.52～1.16)0.78(0.50～1.14) 显性模型[n(%)]293(98.3)177(96.7)0.50(0.15～1.67)0.47(0.13～1.66)0.46(0.13～1.64)rs3025020 CC/CT/TT(孕妇数)131/133/3473/88/22——— 隐性模型[n(%)]34(11.4)22(12.0)1.06(0.60～1.88)1.12(0.62～2.01)1.11(0.62～2.00) 显性模型[n(%)]167(56.0)110(61.1)1.18(0.81～1.72)1.21(0.82～1.78)1.21(0.82～1.78)rs3025040 CC/CT/TT(孕妇数)202/87/9120/56/7——— 隐性模型[n(%)]9(3.0)7(3.8)1.28(0.47～3.49)1.36(0.48～3.84)1.55(0.53～4.55) 显性模型[n(%)]96(32.2)63(34.4)1.11(0.75～1.63)1.11(0.75～1.65)1.19(0.79～1.78)
a 未控制任何变量；b 控制了母亲年龄、文化程度、吸烟、饮酒及家庭月收入； c 敏感性分析结果，即在控制上述变量的基础上又控制了母亲孕前BMI和父亲BMI
本研究采用巢氏病例对照研究设计探讨了母亲VEGFA遗传变异与SGA易感性的关系，结果提示携带G等位基因的孕妇分娩SGA的风险增加。但存在以下局限性。首先，经过FDR校正后，rs2010963变异对SGA的发生风险的影响无显著性，虽然在本研究的样本量之下，有78%的把握度检验出rs2010963变异与SGA易感性的关联性，但是对于MAF较小的位点，本研究的样本量所能达到的把握度有限，需要更大的样本再次验证。其次，本研究缺乏rs2010963致VEGFA表达下调或功能损害的直接证据。VEGFA遗传变异与SGA易感性的研究有待进一步的深入探讨。
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