子宫内膜厚度低于能够获得妊娠的阈厚度称为薄型子宫内膜[1]。关于薄型子宫内膜的定义各家报道不同，目前常用的界定厚度为<7 mm[2]。薄型子宫内膜发生与炎症、药物及医源性损伤等有关。研究发现，卵巢刺激周期中薄型子宫内膜发生率高达38%～66%，体外受精-胚胎移植中薄型子宫内膜发生率为1%～2.5%[3]。由于薄型子宫内膜容易导致妊娠率及胎儿活产率明显降低，而采取辅助生殖技术助孕时，取消移植的概率增加，因此，改善子宫内膜厚度成为提高辅助生殖技术成功率的关键因素之一。人粒细胞集落刺激因子(Human granulocyte colony stimulating factor,G-CSF)是由多种细胞合成的一种特殊细胞因子。研究发现[4]，G-CSF参与了女性生殖系统中卵泡生长发育、排卵、子宫内膜生长、胚胎种植和妊娠维持等诸多方面，对女性生殖功能的维持和调控发挥了重要的促进作用。因此,本研究探讨宫腔灌注G-CSF对于薄型子宫内膜患者冻融胚胎移植(frozen thawed embryo transfer，FET)结局的影响。
对象与方法
1.研究对象:回顾性分析2018年1月至2019年12月在河北省计划生育科学技术研究院和河北省生殖医院生殖科就诊行FET患者的临床资料，采用宫腔灌注治疗的薄型子宫内膜患者76例作为研究组，年龄22～40岁，平均年龄(33.2±4.4)岁。选择同期未采用宫腔灌注治疗，且符合纳入标准，无剔除标准的44例患者作为对照组，年龄21～40岁，平均年龄(33.9±4.9)岁。另将研究组患者的上一个HRT+FET周期(或HRT周期)作为自身对照组(前周期组)。
纳入标准包括(1)激素替代治疗(hormone replacement therapy，HRT)解冻移植周期；(2)年龄≤40岁，体质指数(Body Mass Index，BMI)18.5～28 kg/m2；(3)既往至少一个HRT/HRT-FET周期，内膜转化日内膜厚度<7 mm；(4)尚有1个以上卵裂期D3天胚胎(其中至少一个优质胚胎)冷冻保存。排除标准包括(1)宫腔镜检查提示中、重度宫腔粘连；(2)子宫畸形和子宫内膜病变；(3)输卵管积水；(4)生殖器、盆腔急性感染期的患者；(5)对G-CSF过敏或禁忌症者。
2.子宫内膜的准备方案:月经第3天起口服戊酸雌二醇片(商品名：补佳乐,拜耳医药)2 mg,每日3次,月经第 12天子宫内膜厚度≥7 mm,血E2值>100 pg/mL时添加黄体酮注射液(浙江仙居),每日40 mg 肌肉注射3 d后行D3胚胎移植。若内膜厚度未达到上述指标，将继续口服戊酸雌二醇片至18 d。所有患者均自月经干净起口服阿司匹林肠溶片75 mg/d。移植后戊酸雌二醇继续使用,地屈孕酮片(商品名：达芙通,雅培制药,荷兰)10 mg,每日2次,黄体酮阴道缓释凝胶(8%)(商品名：雪诺酮，默克雪兰诺，英国)90 mg，每日1次进行黄体支持。FET术后14～16 d，血清β-人绒毛膜促性腺激素(β-hCG)≥20 U/L为生化妊娠，继续黄体支持，FET术后28～30 d行阴道超声检查，观察到孕囊即为临床妊娠，孕囊数即为胚胎种植数。
3.宫腔灌注操作方法:研究组患者口服戊酸雌二醇(商品名：补佳乐,拜耳医药)第7天，阴道超声测量子宫内膜厚度、形态及血流动力学参数后，行宫腔灌注治疗。患者取膀胱截石位，以0.1%碘伏消毒外阴及阴道，铺无菌孔巾，窥阴器暴露宫颈，无菌生理盐水棉球擦拭宫颈。将人工授精管和1 mL注射器组合灌注器，抽吸G-CSF 150 μg (国药准字S19991017)0.6 mL，将人工授精管插入宫颈口，缓慢将药液注入宫腔。灌注后患者垫高臀部卧位30 min。灌注5 d后复查阴道超声测量子宫内膜厚度、形态及血流动力学参数。
4.阴道超声测量方法:由同一位高年资医师使用PHILIPS-EPIQ7彩色多普勒超声诊断仪进行测量。3D9-3v阴道探头频率5.0 MHz。测量内容包括(1)子宫内膜厚度。即子宫的中矢状平面中测量子宫内膜-子宫肌层连接的2个界面之间的最大距离[5]。(2)子宫内膜形态。参考Gonen [6]分型分为A型、B型、C型三型。(3)血流分型参考Shokeir [7]，分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。记录两侧子宫动脉搏动指数(pulsate index，PI) 、阻力指数(resistance index，RI) 、收缩期峰值流速/舒张末期流速(systolic peak velocity /diastolic velocity，S/D) 值。
5.评价指标:子宫内膜厚度、形态及内膜血流，平均PI=(左侧PI+右侧PI)/2，平均RI=(左侧RI+右侧RI)/2,平均S/D=(左侧S/D+右侧S/D)/2，周期取消率、临床妊娠率、种植率。临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期数×100%，种植率=孕囊数目/移植胚胎总数×100%。
6.统计学处理:应用IBM-SPSS20.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，两组均数比较采用t检验，多组均数比较采用完全随机设计单因素方差分析。计数资料用率表示，采用χ2检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。
结果
1.一般情况:三组患者的年龄、BMI、不孕年限和转化日孕酮(P)水平比较，差异均无统计学意义。见表1。
表1 三组患者一般情况比较
组别例数年龄(岁)BMI(kg/m2)不孕年限(年)转化日P值(ng/mL)研究组7633.2±4.422.1±2.54.9±2.90.5±0.2对照组 4433.9±4.923.0±2.93.9±2.90.5±0.4前周期组 7633.2±4.422.1±2.54.9±2.90.5±0.2
2.三组患者的子宫内膜厚度、子宫动脉血流参数比较:完全随机设计单因素方差分析发现，各组子宫内膜厚度和RI差异均有统计学意义；子宫动脉PI值和S/D值差异均无统计学意义。进一步LSD多重检验发现，研究组灌注后子宫内膜厚度明显厚于灌注前、对照组和前周期组，差异均有统计学意义。研究组灌注后子宫动脉RI值与前周期组比较,差异有统计学意义。见表2。
表2 三组患者子宫内膜厚度及子宫动脉血流参数的比较
组别例数内膜厚度(mm)∗RI∗PIS/D研究组 灌注前766.6±0.50.86±0.033.00±0.457.34±1.14 灌注后767.3±0.6∗0.85±0.03▲2.98±0.797.19±2.91对照组446.7±0.30.84±0.043.22±0.387.97±0.76前周期组766.6±0.40.87±0.043.10±0.717.62±2.83
各组间比较，*P<0.05；与前周期组比较，▲P<0.05
3.三组患者子宫内膜形态及内膜血流情况比较:A型形态子宫内膜占比在各组间比较，差异均无统计学意义。II型血流子宫内膜占比在各组间比较，差异均有统计学意义。见表3。
4.三组患者FET结局的比较:(1)取消率。研究组的周期取消率明显低于前周期组，组间差异有统计学意义；但研究组与对照组的周期取消率组间差异无统计学意义。(2)临床妊娠率。研究组的妊娠率高于对照组，差异有统计学意义。研究组和前周期组的妊娠率、对照组和前周期组的妊娠率组间差异均无统计学意义。(3)种植率。研究组与对照组的种植率比较，差异有统计学意义。研究组和前周期组的种植率、对照组和前周期组的种植率组间差异均无统计学意义。见表4。
表3 三组患者子宫内膜形态及内膜血流情况比较
组别例数形态[例(%)]A型B型C型血流[例(%)]Ⅲ型Ⅱ型Ⅰ型研究组 灌注前7625(32.9)47 (61.8)4(5.3)027(35.5)49 (64.5) 灌注后7620(26.3)54(71.1)2(2.6)056(73.7)∗20(26.3)对照组4413(29.6)27(61.4)4(9.1)029(65.9)15(34.1)前周期组7624(31.6)45(59.2)7(9.2)014(18.4)62(81.6)
表4 三组患者FET结局的比较
组别总周期数取消率取消周期数移植周期数取消率(%)临床妊娠率妊娠周期数未妊娠周期数妊娠率(%)种植率妊娠囊数未着床胚胎数种植率(%)研究组76205626.3325657.1379927.2对照组44103422.7112332.4125218.8前周期组76324442.1212347.7265930.6
讨论
在胚胎种植的过程中，人类子宫内膜仅在极短时间内才能允许胚胎的植入，而这段时间称为“种植窗”。除胚胎质量外，子宫内膜容受性也是妊娠成功的关键因素。薄型子宫内膜是导致子宫内膜容受性降低的原因之一。因此，增加薄型子宫内膜患者子宫内膜厚度，改善内膜容受性，是提高辅助生殖技术(assisted reproductive technology，ART)成功率的关键。G-CSF是一种糖蛋白，具有免疫调节、保护血管、促进血管发生的作用。G-CSF在哺乳动物的成功妊娠中具有重要的作用,其在卵巢颗粒细胞、睾丸间质细胞、胎盘、子宫内膜细胞中均有表达,它可能参与了人卵泡颗粒细胞、胎盘及子宫内膜的生长、发育[8]。Zhao等[9]在薄型子宫内膜大鼠模型中研究发现，皮下注射G-CSF，能使大鼠内膜明显增厚，细胞角蛋白和波形蛋白表达明显增强，认为G-CSF能促进子宫内膜细胞再生修复，且早期给予G-CSF内膜增殖效果更好。Gleicher等[10]的一项队列研究显示,在人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG)注射日宫腔灌注G-CSF(300μg)，可使患者的平均子宫内膜厚度由6.4 mm增加至9.3 mm,并获得19.1%继续妊娠率。因而认为宫腔灌注G-CSF对薄型子宫内膜具有促进增殖的作用。本研究宫腔灌注的G-CSF药物剂量为150 ug，研究结果显示，研究组灌注后子宫内膜厚度明显高于灌注前、对照组和前周期组，提示宫腔灌注150 ug的G-CSF也同样能改善薄型子宫内膜的厚度。
目前,子宫内膜容受性与子宫动脉血流动力学参数的相关性研究表明，子宫内膜厚度与子宫动脉血流动力学参数之间有相关关系[11]。子宫内膜血流间接反应胚胎种植部位的微环境。孙莹璞等[12]通过双侧子宫血流动力学参数变化评价移植前子宫内膜容受性的研究结果显示，hCG注射日子宫动脉PI 和RI 越高,子宫内膜越薄。本研究结果显示，灌注后II型血流子宫内膜占比比灌注前和前周期组高，但研究组灌注后与对照组比较，差异无统计学意义；研究组灌注后子宫动脉RI与前周期组比较,组间差异有统计学意义；但子宫动脉PI值和S/D值在研究组灌注后、灌注前、对照组和前周期组四组之间比较，差异均无统计学意义。因此，推断宫腔灌注G-CSF可能通过改善子宫内膜血流来增加内膜厚度，但尚不能推断宫腔灌注G-CSF可改善子宫动脉相关参数。
研究表明[13],在既往卵巢刺激周期或冻胚移植周期出现薄型子宫内膜的患者，在再次冻胚移植时，采用激素替代方案实施冻胚移植同时予以多次的宫腔灌注G-CSF可以减少移植的取消率、增加移植内膜的厚度并提升胚胎的种植率和妊娠率。本研究显示，研究组周期取消率明显低于前周期组，但研究组与对照组周期取消率比较,差异无统计学意义。表明,对于既往因薄型内膜周期取消移植的患者，宫腔灌注G-CSF可以改善内膜厚度，增加移植的机会。
一项纳入2个RCT、5个非RCT和7个队列研究的Meta分析[14]显示，G-CSF灌注治疗可明显改善子宫内膜厚度，提高临床妊娠率并降低人工周期取消率，但在胚胎种植率方面没有明显提高。同时，该研究将患者的年龄进一步分层显示，年龄 ≤39岁的患者，G-CSF灌注可以改善子宫内膜厚度，提高临床妊娠率和胚胎种植率。本研究纳入的研究对象年龄≤40岁，研究组的妊娠率和种植率均高于对照组，但研究组和前周期组，对照组和前周期组的妊娠率、种植率比较，差异均无统计学意义。提示，宫腔灌注G-CSF可能使一部分薄型子宫内膜患者获益，但并不能使不加选择的所有患者改善FET结局。因此，在未来的临床实践和设计研究中，需要甄别哪些患者将是是宫腔灌注G-CSF潜在的获益者，从而确定宫腔灌注G-CSF的适应症，以提高宫腔内灌注G-CSF临床和研究价值。
虽然宫腔灌注G-CSF对改善薄型子宫内膜患者FET结局的研究在学界方兴未艾，但对于最佳的给药途径、给药时间、给药剂量都尚未达成共识，导致各个研究结论不尽相同。此外，本研究因样本量较小、未能对FET流产率、异位妊娠率和子代的健康情况进行观察。
综上所述，宫腔灌注G-CSF治疗可改善薄型子宫内膜厚度，降低激素替代FET周期取消率，提高胚胎种植率和妊娠率。
1 哈灵侠，袁莹莹，裴利国,等.粒细胞集落刺激因子宫腔灌注在改善薄型子宫内膜中的应用价值.中国妇幼保健,2015,30:82-85.
2 Liu KE,Hartman M,Hartman A, et al.The impact of a thin endometrial lining on fresh and frozen-thaw IVF outcomes:an analysis of over 40000 embryo transfers.Hum Reprod,2018,33:1883-1888.
3 Liu KE,Hartman M,Hartman A.Management of thin endometrium in assisted reproduction:a clinical practice guideline from the Canadian Fertility and Andrology Society.Reprod Biomed Online,2019,39:49-62.
4 Wurfel W．Treatment with granulocyte colony-stimulating factor in patients with repetitive implantation failures and /or recurrent spontaneous abortions．J Reprod Immunol,2015,108:123-135.
5 Groenewoud ER,Cohlen BJ,Al-Oraiby A,et al.Influence of endometrial thickness on Pregnancy rates in modified natural cycle frozen-thawed embryo transfer.Acta Obstet Gynecol Scand,2018,97:808-815.
6 Gonen Y,Casper RF.Prediction of implantation by sonographic appearance of the endometrium during controlled ovarian stimulation for in vitro fertilization (IVF).J In Vitro Fert Embryo Transf,1990,7:146-152.
7 Shokeir T,Ebrahim M,Elmogy H.Hysteroscopic-guided local endometrial injury does not improve natural cycle Pregnancy rate in women with unexplained infertility:Randomized controlled trial.Obstet Gynaecol Res,2016,42:1553-1557.
8 哈灵侠,袁莹莹,裴利国,等.粒细胞集落刺激因子宫腔灌注在改善薄型子宫内膜中的应用价值.中国妇幼保健,2015,30:82-85.
9 Zhao J，Tian T，Zhang Q，et al．Use of granulocyte colony-stimulating factor for the treatment of thin endometrium in experimental rats．PLoS One，2013，8:e82375.
10 Gleicher N，Kim A，Michaeli T，et al．A pilot cohort study fgranul cytecolony -stimulating factor in the treatment of unresponsive thin ndometrium resistant to standard therapie．Hum Reprod，2013，28:172-177.
11 Miwa I,Tamura H,Takasaki A,et al.Pathophysiologic features of “thin”endometrium.Fertil Steril,2009,91:998-1004.
12 孙莹璞,刘美霞,苏迎春,等.经阴道彩色多普勒监测子宫血流动力学变化评价IVF-ET 中子宫内膜接受性.生殖与避孕,2005,25:99-101.
13 汪茜,付晨星，李小平,等.粒细胞集落刺激因子对冻融胚胎移植周期薄型子宫内膜的治疗效果.贵州医科大学学报,2017,42:486-489.
14 谢易冉,田正平,张加苗,等.宫腔内灌注G-CSF对改善薄型子宫内膜临床疗效的系统评价与Meta分析.生殖医学杂志,2017,26:537-545.