·综述·
胎盘是连接母胎的重要部分，有屏障作用、物质交换、分泌激素、免疫调控等功能。各种妊娠期母儿疾病均与胎盘功能密切相关。涉及到胎盘的许多研究因伦理问题无法直接在人体开展，动物实验的结果虽有一定参考意义，但又难以全面外推至人体。离体胎盘灌注模型的提出解决了这一难题。
离体胎盘灌注模型最早是由Panigel等[1]提出的，通过灌流管连接供应同一胎盘小叶的脐静脉与脐动脉建立胎儿侧循环，灌流管插入螺旋动脉残端建立母体侧循环，主要用于药物经胎盘转运的相关研究。后经过Schneider等[2]和Miller等[3]的改进，逐渐形成了如下成熟的离体胎盘灌注模型。
收集胎盘并进行灌洗后，在保留完整胎盘的基础上，确定供应同一胎盘小叶的脐静脉与脐动脉，结扎其分支，穿刺置管建立该小叶的胎儿循环，当脐动脉端灌入量与脐静脉端流出量相等时说明该胎盘小叶无渗漏，去除多余的胎盘组织，在该胎盘母体侧绒毛间隙内插入两灌流管2～3 mm建立母体循环。离体胎盘灌注模型建立后，母体侧灌注液用95%的O2和5%的CO2混合气体进行氧合，胎儿侧则用95%的N2和5%的CO2混合气体充气，以模拟母体血与胎儿脐动脉血的体内状态[4]。实验过程中可通过测量胎儿循环侧pH、温度、压力、耗氧量、胎儿净氧转移、乳酸产量等指标来衡量离体组织活性，但胎儿侧灌注液体积损失测量则被认为是最佳的评价指标，考虑液体残留及水分蒸发，通常胎儿侧灌注液损失量不超过2～4 mL/min提示该循环建立成功。安替比林是一种亲水性的小分子化合物，通过被动扩散进入胎盘，因此常被作为胎盘转运研究的阳性参照物，在母体侧以100%的浓度加入安替比林，灌注2.5 h后安替比林的F/M值>0.75才能说明模型建立成功[4]。经不断改进后的离体胎盘灌注模型，被应用于药物与疾病的各方面研究。
有研究发现，约23%～85%的妊娠妇女在妊娠期间需要进行药物治疗[5]，但胎盘屏障作用有限，部分对胚胎有毒性作用的药物进入母体循环后可能通过胎盘进入胎儿循环，从而影响胎儿的生长发育，甚至产生致畸或致死作用。因此，评估胎儿的药物暴露水平成为衡量妊娠期用药安全的重要指标。离体胎盘灌注模型保留了完整的胎盘结构，是评估药物经胎盘转运的最经典的方法。
药物胎盘转运机制包括被动扩散、主动运输、易化扩散、过滤和胞饮作用。其中被动扩散是胎盘转运的重要机制，受物质分子量大小、离子化程度、脂溶性高低等因素影响。通过在开放或封闭离体胎盘灌注系统中进行药物经胎盘转运实验发现，部分药物以被动扩散形式通过胎盘屏障进入母胎循环，例如抗病毒药物替诺福韦[6]、阿昔洛韦[7]，内分泌用药溴隐亭[8]等。这些被动扩散物质游离与结合状态的平衡很大程度上影响其经胎盘的运输，故而母体侧血清白蛋白与胎儿侧血清白蛋白浓度是该类物质经胎盘转运的重要限制因素。例如溴隐亭与母体侧蛋白结合率高，其分子量较大，研究显示只有微量溴隐亭通过胎盘转运，其胎儿转移率约6%[8]。而Lee等[9]的研究则表明，降糖药物二甲双胍的胎盘转运是由OCT3(organic cation transporter)介导的。Kurosawa等[10]和Freriksen等[11]通过采集不同药物经胎盘转运的数据结合药代动力学模型分析以及hutson等[12]进行的一项meta分析(n=26)均表明，离体胎盘灌注模型进行药物实验所得数据与临床观察脐血中相关药物数据高度一致，这表明离体胎盘灌注模型是研究药物经胎盘转运的理想模型。
既往研究证实，万古霉素[13]、罗格列酮[14]、人胰岛素[15]、溴隐亭[8]等药物极少甚至不透过胎盘，在孕期使用有较高的安全性；而缩宫素即使在低于生理浓度的条件下，仍可以由母体侧转运至胎儿侧[16]，故在临床上使用缩宫素进行催产时，应以与生理分娩进展速率相适应的最低剂量给药；西地那非是一种通过增强一氧化氮(NO)途径介导血管舒张的药物，动物实验证明其可通过改善子宫胎盘血供从而改善子痫前期母胎结局[17]，但在一项大型临床实验研究中发现，西地那非的应用可能导致一些新生儿疾病甚至新生儿死亡[18]，后利用体外胎盘灌注证实，西地那非可通过健康妇女胎盘，且在子痫前期妇女胎盘中，越早孕周西地那非透过胎盘的剂量越大[14]。这些结果对于指导西地那非的临床用药有很大参考价值。
甲醛是常见的家居污染物，动物实验证实暴露于甲醛的小鼠均出现了生殖系统损害以及胎儿畸形[19]和胎盘损伤[20]，人离体胎盘灌注模型实验证实，甲醛从母体侧经胎盘迅速转移至胎儿侧，通过与蛋白质、核酸、氨基酸等多种生物分子代谢并发生反应，引起DNA-蛋白质交联，从而在胎盘和胎儿组织中积累，造成胎盘滋养细胞层出现氧化应激样反应，导致胎盘功能障碍[21]。对羟基苯甲酸酯是一类广泛用于日常用品的防腐剂，存在潜在的内分泌干扰作用，孕期苯甲酸酯的暴露可能导致胎儿体重过度增长[22]，而体外胎盘实验则证实，不同种类苯甲酸酯以及不同浓度苯甲酸酯经胎盘转运时无明显运输动力学差异[23]，但其对胎儿的影响仍需进一步实验研究。草甘膦是众多除草剂的有效成分，既往也被认为是除草剂毒性的主要成分，但在离体胎盘模型实验中发现，以草甘膦为基础的复方农药比单独的草甘膦对胎盘循环和其完整性有更严重的损害，这些复方农药的配方里含有聚氧乙醇胺、多环芳烃或重金属等，这可能是其对胎盘毒性高于单独草甘膦的原因，这也解释了暴露于不含草甘膦的杀虫剂或其他环境污染物的孕妇亦出现不良妊娠结局的原因[24]。因此，仅以草甘膦作为除草剂毒性所在的说法有待商榷。大量研究表明，空气污染与不良妊娠结局之间存在一定关联，但对于污染颗粒毒性背后机制以及是否能穿过胎盘进入胎儿循环仍未可知。Bongaerts等[25]利用离体胎盘灌注模型进行柴油尾气颗粒(diesel exhaust particles,DEPs)的转运和积累研究发现，经过6 h灌注后，DEPs的胎母比值接近于零，在胎儿侧灌注液中没有检测到明显DEPs颗粒，但在胎盘组织，尤其是合胞滋养层中，检测到大量DEPs颗粒蓄积，并在胎儿侧上皮细胞中检测到少量DEPs颗粒，表明其毒性作用主要是对胎盘功能影响，但该实验在胎儿侧上皮细胞检测到少量的DEPs，故亦不排除其直接的胎儿毒性作用。氯氰菊酯、唑丙环唑、比特醇等农药中含有的化学物品[26]、纳米级粒子[27]等均可通过胎盘屏障进入胎儿循环。人离体胎盘灌注模型是一个有价值的研究环境污染物对母胎影响的系统，值得在环境化学物质研究中得到越来越多关注。
妊娠合并症与并发症多通过影响胎盘功能从而影响胎儿的生长发育，建立体外的胎盘疾病模型有助于进一步研究的开展。子痫前期(preeclampsia,PE)是一种严重影响母胎安全的妊娠期高血压疾病，目前其发病机制被认为与孕早期胎盘浅着床以及孕中晚期胎盘氧化应激反应高度相关，建立PE的体外胎盘模型有助于更加透彻的研究其发病机制。对健康离体胎盘组织进行缺氧灌注后发现，母体侧及胎儿侧不同炎症因子、氧化应激标志物，例如内皮素-1(ET-1)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)均有不同水平的升高，很好的模拟了PE的胎盘炎症反应[28]；通过对比PE产妇及正常产妇离体胎盘的三维血管模型发现，PE产妇胎盘血管床体积较正常产妇减少，1～3级静脉和2～3级动脉管径变小，外周动静脉比增高，这可能是导致PE胎盘灌注不足的原因之一[29]。PE离体胎盘微囊泡结合的一氧化氮合酶(STBEV-eNOS)水平较低导致NO减少[30]，大电导钙激活钾通道(BKCA通道)的表达下调[17]都可能是导致胎盘血管收缩的原因。从PE离体胎盘分离的微囊泡(STBEV)能导致血小板的活化[31]，这可能是PE患者血液高凝的原因。妊娠期糖尿病可能导致早期流产、早产、胎儿生长受限、胎儿畸形、巨大儿等不良妊娠结局，在高糖灌注液模拟的妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)胎盘模型中，发现胎儿血管阻力显著增加，同时检测到内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和蛋白激酶(Akt)磷酸化水平降低，这一结果提示高糖通过降低NO的生成，导致血管阻力升高[32]。被疟原虫感染的红细胞表面表达恶性疟原虫红细胞膜蛋白1(PfEMP1)，介导细胞与内皮细胞、血小板、红细胞和合胞滋养细胞的粘附，从而逃避循环和免疫，VAR2CSA作为PfEMP1家族的一员，与硫酸软骨素A(chondroitin sulfuric A,CSA)结合，从而在体外胎盘灌注模型中积累，其分布与自然感染相似，而可溶性CSA和抗VAR2CSA抗体抑制了感染红细胞的结合[33]，这一发现为胎盘疟疾疫苗的开发提供了新的研究方案。基于此，Pehrson等[34]在随后的研究中发现，一种脂质体制剂中的ID1-ID2a蛋白(目前处于I期试验)有效地诱导了抑制胎盘组织中感染红细胞粘附的抗体。在对胎儿生长受限(fetal growth restriction,FGR)胎盘的研究中发现，吲哚胺2,3-双加氧酶-1(IDO1)的缺乏会导致色氨酸降解减少，其产生的免疫抑制及胎盘血管舒张作用减弱[35]，与FGR的发生密切相关[36]。FGR也可能与胎儿-胎盘血管反应性改变有关[37]，在对比正常胎盘与FGR胎盘离体条件下对前列腺素E2(PGE2)的反应性的实验中发现，FGR胎盘对PGE2反应性较正常组降低[38]，证实了上述可能。灌注液中加入牛磺胆酸则可建立妊娠期肝内胆汁淤积症(Intrahepatic cholestasis of pregnancy,ICP)模型[39]。利用离体胎盘灌注模型还可建立更多疾病胎盘模型，以助于更好的进行相关疾病发生发展机制的研究。
针对妊娠期疾病的部分治疗措施在动物实验中有较好效果，但难以在人体直接开展实验进行验证，且相关治疗的机制亦有待明确。例如在PE和正常的离体胎盘灌注模型的母体灌流液中加入硫酸镁，PE组可溶性FMS样酪氨酸激酶-1(sflt-1)浓度较正常对照组并未增加[40]，提示硫酸镁对子痫前期的治疗作用仅在于预防子痫，而与PE相关的抗血管生成状态无关。使用编码VEGF异构体的腺病毒(Ad)在动物模型中转导子宫动脉可以增加子宫-胎盘血液灌注量(utero-placental blood perfusion,UBF)并改善胎儿在子宫内的生长[41]，但应用于人体需验证其安全性，在离体胎盘的实验中发现，胎儿侧静脉灌流液中很少检测到病毒载体，检测到病毒载体时滴度也非常低[42]，这一结果为该治疗方法应用于人体提供了一定的依据。双胎输血综合征(twin to twin transfusion syndrome,TTTS)的治疗十分有限，激光治疗是目前较好的办法，利用离体胎盘灌注模型研究TTTS激光治疗时相关因素的影响可为治疗细节提供更多的指导[43]。干细胞的移植是治疗妊娠期相关疾病的研究热点，体外胎盘灌注模型是研究间充质干细胞的胎盘迁移和定植的良好工具，将荧光标记的间充质干细胞注入离体胎盘灌注模型的血管，从胎盘中将注射后的血管分离、培养、制作切片，可见间充质干细胞穿过血管内皮屏障，实验中同样发现，穿过血管壁迁移的间充质干细胞仍在血管生态位内，并不迁移至周围组织中，相关机制有待进一步研究明确[44]。
进入胎盘的物质并非均以原型进入胎儿循环，胎盘的代谢功能对于物质经胎盘转运有一定影响。例如雌激素玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)进入胎盘后，经代谢形成活性较高的雌激素及活性较低的ZEN-14-硫酸盐结合物释放入母体和胎儿循环[45]。皮质醇在胎盘中被11β-羟基类固醇脱氢酶(11β-hydroxysteroid dehydrogenase 2,11β-HSD2)快速代谢为可的松，而皮质醇亦会影响色氨酸在胎盘中的代谢[46]。吲哚胺2,3-双加氧酶-1(IDO1)是色氨酸(TRP)分解过程中的一种酶，绒毛膜的血管内皮细胞和蜕膜螺旋动脉的内皮细胞有其定值。IDO1介导的TRP在内皮细胞分解代谢可能产生抗菌活性和免疫抑制，以及胎盘血管紧张的松弛，从而促进胎盘灌注和胎盘及胎儿的生长。但胎盘中的TRP降解酶也会导致色氨酸的缺乏，这两个过程的结合对建立和维持胎儿-母体免疫耐受具有重要意义[36]。胎盘对于不同物质的代谢与其含有的特殊的酶及相关蛋白有关，离体胎盘灌注模型可让研究者更彻底地研究胎盘的代谢功能。
综上所述，离体胎盘灌注模型在研究疾病、药物、环境等对母胎的影响上有很高应用价值。其作为最接近生理条件的模型，是用于研究胎盘功能最经典的方法，但也存在一定的局限。例如实验中多采用的是妊娠晚期剖宫产或顺产的胎盘，妊娠晚期随着妊娠进展，胎盘功能逐渐减退，实验所得出相关结果难以完全代表妊娠早期的胎盘状况；离体后的胎盘虽在接近于生理的条件下进行试验，但在例如酶活性、转运体数量、胎盘组织在制备过程中缺血缺氧所致本身损伤等方面与体内均有一定差异。基于此，近来有学者将离体胎盘灌注与数学建模相结合[47]，进一步明确胎盘灌注系统的各种实验条件控制及相关影响因素，这使得研究者可更加便利地模拟各种条件下胎盘功能的研究。尽管离体胎盘灌注存在一定不足，但作为目前研究胎盘功能最经典的方法，仍然是众多研究者的选择，在今后的研究中，可对影响离体胎盘灌注的各项因素进行更深入的了解，以提供更加接近体内环境的离体胎盘灌注模型。
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