胎儿生长受限(fetal growth restriction，FGR)是产科常见的并发症之一，国内发病率为6%～13%[1]，可导致围产期的不良妊娠结局，亦增加成人期代谢性疾病的发生风险。FGR不仅在单胎妊娠中发生，双胎妊娠时，两胎儿生长不一致也会表现为一胎儿FGR，单绒毛膜双胎妊娠(monochorionic double amniotic，MCDA)和双绒毛膜双胎妊娠(double chorionic double amniotic，DCDA)诊断标准略有不同，但均存在一胎儿存在生长受限的情况。尽管MCDA发生选择性胎儿生长受限(selective fetal growth restriction，sFGR)的风险更高，但在排除宫内胎儿死亡和MCDA特异性并发症后，绒毛膜性质不同的双胎在产科并发症、新生儿死亡率和发病率方面并无差异[2]。新生儿发病率和死亡率随两胎儿体重差异增加而升高，当体重差异在26%～30%时，相对危险度为2.9，当差异升高到31%～40%时，相对危险度达5.6[3]。DCDA发生生长不一致的原因主要为胎盘灌注不足，研究显示DCDA中生长受限儿更容易发生胎儿窘迫，且在发生胎儿窘迫前超声显示其脐动脉搏动指数(pulsatility index，PI)与单胎生长受限儿的表现一致，均为逐渐增加，而MCDA合并有双胎输血综合征的小胎儿超声表现为心输出峰速增加，并无PI的变化[4]。
代谢组学是最接近表型的组学研究手段，能够直接反映机体因生理或病理情况发生的变化。既往已有多项研究将代谢组学应用于围产领域来帮助诊断和预测妊娠期并发症如子痫前期[5-6]，妊娠期糖尿病[7-8]等，从代谢的角度加深对疾病发生机制的理解。而应用于FGR的研究主要集中在单胎妊娠，以及发生在MCDA的sFGR[9-16]，尚无研究关注DCDA双胎生长不一致。本研究利用基于超高效液相色谱-质谱联用仪(UPLC-MS)的非靶向代谢组学方法筛选双胎生长不一致两胎儿脐血差异代谢物，以期为DCDA胎儿生长异常及FGR的发生机制提供更多线索。
对象与方法
一、研究对象
本研究为回顾性病例对照研究，经北京大学第三医院医学伦理委员会批准[(2017)医伦审第(089-02)号]。本研究纳入2017年7月—2020年7月在北京大学第三医院建档并规律产检的双胎妊娠孕妇。
1.纳入标准：DCDA，双胎均活产，孕妇年龄18～45岁；按照《双胎妊娠临床处理指南》[17]筛选双胎生长不一致病例。生长不一致诊断标准：双胎中一胎儿估测体重<同胎龄第3百分位数；或一胎儿符合以下3个条件中的至少2个：(1)一胎估测体重<第10百分位数；(2)2个胎儿估测体重差异≥25%；(3)较小胎儿的脐动脉搏动指数>第95百分位数。
2. 排除标准：母体孕期严重并发症或合并症，如重度子痫前期，早发型子痫前期、妊娠期糖尿病等急慢性病史；胎儿染色体异常或先天性畸形。
二、研究方法
1. 临床信息采集：(1)孕妇一般资料。主要包括年龄、身高、孕前体重等；(2)孕妇临床资料。主要包括孕产次、既往疾病史、本次妊娠方式、并发症、分娩孕周、分娩方式、有无胎膜早破等；(3)胎儿资料。主要包括性别和出生体重。
2. 样本采集与储存：采集分娩时两胎儿脐血2～4 mL于EDTA抗凝管中离心后，移取上层血浆并分装于1.5 mL离心管中，-80℃冰箱保存至检测。
3. 非靶向代谢组学研究:
(1)仪器与试剂。液相色谱质谱联用仪(UPLC-MS)配备有：DionexTM UltiMateTM 3000超高效液相色谱(美国Thermo公司)，Q ExactiveTM四极杆轨道离子阱质谱(美国Thermo公司)以及XCalibur质谱数据采集软件(美国Thermo公司)。BEH Amide(1.7 μm 2.1 mm*100 mm)亲水作用色谱柱(美国Waters公司)，Mix-3000 震荡混匀器(杭州米欧仪器有限公司)，Mikro 220R台式高速冷冻离心机(德国Hettich公司)，真空离心浓缩仪(美国Thermo公司)，色谱纯甲醇、乙腈、甲酸、乙酸铵(美国Fisher Scientific)，氨基酸同位素混合内标(美国CIL公司)。
(2)样品制备。血浆样本在4°C冰箱融化30～60分钟，取100 μL血浆至1.5 mL离心管中，加入300 μL的乙腈，充分振荡15秒，进行蛋白沉淀。12 000 rpm，4℃，离心10分钟。取上层液100 μL，加入10 μL内标(内标原液用75%乙腈稀释5倍，成待加的内标液)。涡旋10秒，置于200 μL内衬管中，待测。
(3)色谱条件。色谱柱：Waters UPLC BEH Amide(1.7 μm, 2.1 mm*100 mm)；流动相：A相为乙腈(含0.1%甲酸，10 mM乙酸铵)和B相为水(0.1%甲酸，10 mM乙酸铵)；洗脱程序见表1。流速：0.3 mL/min；进样量为1 μL；柱温：40℃。
表1 样本洗脱程序
Table 1 Sample elution procedure
Time (min)A (v%)B (v%)0955195575050950509.195511955
4. 质谱条件：质谱分析采用装备了热电喷雾离子源的四极杆轨道离子阱质谱仪(ThermoFisher Scientific Q ExactiveTM)。正离子离子源电压为3.7 kv。毛细管加热温度320 ℃。鞘气压力30 psi，辅助气压力10 psi。容积加热蒸发温度300 ℃。鞘气和辅助气均为氮气。碰撞气为氮气，压力为1.5 mTorr。一级全扫描参数为：分辨率70 000，自动增益控制目标为1 × 106，最大隔离时间50 ms，质荷比(m/z)扫描范围50～1 500。液质系统由Xcalibur 2.2 SP1.48软件控制，数据采集由该软件操作。
5. 样本分析质控：为了评价样本分析过程中仪器系统的稳定性和重复性，应用质控样本(quality control，QC)和内标监测整个分析过程。QC样本为所有样本等体积混合得到，前处理方法同真实样品。分析过程中，先采用5个空白样本平衡色谱柱，再用3个质控样本平衡柱条件；继而每间隔6～8个样本插入1个质控样本，监测整个液质系统的稳定性和重复性。计算质控样本中提取的代谢特征的变异系数值，变异系数超过30%的代谢特征被删除。
6. 非靶向代谢组学数据处理：将采集的原始数据，应用Progenesis QI软件处理，包括原始数据导入、峰对齐、峰提取、归一化等步骤，获得保留时间、质荷比和峰强度的三维数据表格文件。色谱提取峰的时间为1至11 min，峰提取的强度限定为模式3。各种加合离子如加氢和加钠等均去卷积到每一个离子特征。依据80%规则去除得到代谢物特征的零值[18]。应用statTarget基于QC信号进行随机森林信号偏移校正(random forest signal correction，RFSC)方法[19]，对所有样本的代谢特征进行校正。采用Simca(Umetrics，版本14.1)统计分析软件，Pareto scaling数据标准化处理。偏最小二乘判别分析(PLS-DA)用于比较两胎儿代谢物的情况。根据PLS-DA模型计算得到变量权重值(variable importance for the projection，VIP)，以VIP>1为筛选标准，结合单变量统计分析Wilcoxon符号秩检验、变化倍数(fold change, FC)分析，筛选差异代谢物特征。使用R软件绘制火山图，散点图绘制采用GraphpadPrism 8.3软件完成。差异代谢物鉴定通过与HMDB、KEGG和mzCloud等数据库(搜库一级质谱和二级质谱误差均为10 ppm)以及标准品的准确质量数、二级谱碎裂规律等比对确定。热图及代谢通路富集用MetaboAnalyst 5.0分析获得。
结 果
一、母体和胎儿一般情况
按照纳入和排除标准共筛选出双胎生长不一致26例，孕妇平均年龄(33.2±4.6)岁，BMI平均为(22.1±2.7)kg/m2，均为初产妇，均通过ART妊娠，分娩平均孕周(36.4±1.6)周。小胎儿平均出生体重为(1 966.8±305.8)g，大胎儿为(2 837.4±410.2)g，两者有统计学差异(P<0.001)，且小胎儿体重均低于同胎龄第10百分位数；双胎性别组成：女/女 3例，男/男 8例，男/女 15例。
二、代谢组学分析结果
1.数据质量控制评价：样本分析过程中，每隔6～8个样本插入1个QC以及使用氨基酸同位素混合内标溶液监测液质系统的稳定性和重复性。氨基酸内标在校正后的相对标准差(relative standard deviation，RSD)为2.6%至10.5%，均低于20%，提示所有样本分析过程中仪器信号稳定、重复性好。应用statTarget对QC样本进行校正，图1(a)计算所有QC样品中检测到的代谢物的RSD，校正后所有QC样品代谢物的RSD均下降，RSD≤10%的代谢物数量增多(由53%提高到95%左右)，使得QC样品在质控标准范围内(RSD<30%)可重复检测，见图1 (b)。
图1 (a)代谢物特征校正后RSD分布图；(b)代谢物特征校正后RSD变化图
Figure 1 (a) RSD distribution of metabolite profiles after adjustment; (b) Changes in RSD of metabolite profiles after adjustment
2.双胎生长不一致脐血代谢组学分析：采用PLS-DA模型的得分图显示两组样本分开趋势明显，提示生长不一致两胎儿脐血代谢物具有差异，见图2(a)。以VIP>1、P<0.05、FC>1.2或FC<0.83作为筛选条件，共筛选出318个差异代谢物，结果以火山图呈现，见图2(b)，红色点代表与大胎儿相比，小胎儿脐血中有94个化合物上调，蓝色点代表与大胎儿相比，小胎儿脐血中有224个化合物下调，灰色点代表无显著差异的代谢物。经搜库及标准品比对，最终鉴定出35个代谢物(表2)。对鉴定出的差异代谢物进一步做聚类分析，用热图呈现(图3)，与大胎儿相比，有25个差异代谢物在小胎儿中表达下调，10个上调。
图2 (a) PLS-DA得分图，S代表双胎生长不一致中体重较小胎儿，L代表体重较大胎儿；(b) 差异代谢物火山图
Figure 2 (a)PLS-DA score map. S stands for the smaller fetus with discordant twin growth, and L stands for the larger fetus; (b) Volcano plot
图3 差异代谢物聚类分析热图S代表双胎生长不一致中体重较小胎儿，L代表体重较大胎儿
Figure 3 Cluster analysis heatmap. S stands for the smaller fetus with discordant twin growth, and L stands for the larger fetus
表2 双胎生长不一致脐血差异代谢物
Table 2 Cord blood differential metabolites in twins with discordant growth
Differential metabolitem/zRT/minFCtrendPVIPHMDBCholine104.10710.970.79↓0.011.5HMDB000974-Hydroxyisoleucine148.09675.380.76↓0.041.6HMDB33453L-Methionine150.05826.601.29↑0.021.6HMDB00696L-Arginine175.11897.150.83↓0.041.0HMDB005175-Hydroxyindoleacetic acid192.06544.770.81↓0.021.5HMDB00763L-Kynurenine209.09184.770.83↓0.021.4HMDB00684L-Cystathionine223.07477.620.59↓<0.01 2.3HMDB00099CitrusinineII288.08676.780.66↓0.031.6HMDB303735'-Methylthioadenosine298.09651.50.73↓0.021.5HMDB01173Progesterone315.23180.891.26↑0.011.3HMDB01830Trans-2-Dodecenoylcarnitine342.26340.961.21↑<0.01 1.1HMDB1332617alpha,21-Dihydroxypregnenolone349.2370.881.39↑0.041.7HMDB06762Prostaglandin D3351.21610.911.28↑0.011.7HMDB03034LysoPC(14:0/0:0)468.30782.330.75↓0.031.9HMDB10379LysoPE(18:1(9Z)/0:0)480.30880.970.82↓0.011.2HMDB11506LysoPC(16:1(9Z)/0:0)494.32362.210.56↓<0.012.9HMDB10383LysoPE(0:0/20:4(5Z,8Z,11Z,14Z))502.29212.370.55↓<0.013.2HMDB11487LysoPC(18:3(6Z,9Z,12Z)/0:0)518.32172.170.77↓<0.011.8HMDB10387LysoPC(18:2(9Z,12Z)/0:0)520.33892.110.78↓<0.011.3HMDB10386LysoPC(18:1(11Z)/0:0)522.35462.040.68↓<0.012.3HMDB10385LysoPC(20:4(5Z,8Z,11Z,14Z)/0:0)544.33910.970.72↓0.012.0HMDB10395LysoPC(20:3(5Z,8Z,11Z)/0:0)546.35492.010.63↓<0.01 2.4HMDB41547LysoPC(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/0:0)568.33871.960.68↓<0.01 1.9HMDB10404Sm(d18:2/14:0)673.52661.030.81↓0.041.2HMDB0240637PC(14:0/16:0)706.53751.020.81↓<0.01 1.6HMDB07869PE-NMe2(18:2(9Z,12Z)/14:0)716.52181.361.8↑0.012.6HMDB0114065PC(14:0/P-18:0)718.57291.350.79↓0.031.6HMDB07896SM(d18:1/18:1(9Z))729.58931.040.79↓0.011.5HMDB12101PC(18:4(6Z,9Z,12Z,15Z)/15:0)740.52221.031.33↑0.031.5HMDB08231PE(18:3(9Z,12Z,15Z)/18:0)742.53691.021.76↑0.012.6HMDB09156PC(14:0/20:1(11Z))760.58294.850.73↓0.011.6HMDB07879PE(16:1(9Z)/22:5(7Z,10Z,13Z,16Z,19Z))764.52191.021.34↑0.021.7HMDB08978PE-NMe(18:2(9Z,12Z)/22:5(7Z,10Z,13Z,16Z,19Z))804.55151.330.83↓<0.01 1.4HMDB0113189PE-NMe2(18:0/22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z))820.58311.011.32↑0.031.4HMDB0114008NeuAcalpha2-3Galbeta-Cer(d18:1/16:0)991.67012.150.75↓0.021.5HMDB0061363
应用MetaboAnalyst 5.0对筛选到的差异代谢物进行代谢通路分析和富集分析，见图4，圆圈越大，红色越深，代表根据数据确定的代谢物对其相关的代谢途径有重要影响，胎儿体重相关的差异代谢物主要与蛋氨酸代谢，精胺代谢，甜菜碱代谢、甘油磷脂等代谢通路有关。
图4 (a)SPMDB数据库富集分析；(b)通路分析
Figure 4 (a)SPMDB database enrichment analysis; (b) Pathway analysis
讨 论
DCDA胎儿因起源于2个受精卵，所处母体环境相同，但在遗传方面具有生长潜能的差异；然而遗传学的差异可能并非导致生长不一致甚至一胎儿生长受限的主要原因。本研究中生长不一致组的小胎儿体重均低于同孕龄儿应有体重的第10百分位数，提示这一胎儿存在生长受限的情况。因此，本研究结果从代谢角度对FGR的发生机制具有借鉴意义。目前有关代谢组学在DCDA胎儿生长发育中的研究十分有限。本研究首次应用UPLC-MS非靶向代谢组学的分析方法对DCDA双胎生长不一致脐血差异代谢物进行探索，发现生长受限儿与正常胎儿代谢轮廓存在差异，主要体现在氨基酸代谢、磷脂代谢等，尽管研究样本不同，但所涉及代谢通路与本团队前期应用气相色谱技术在sFGR中的发现一致[20]，提示这些代谢通路对胎儿生长发育起重要作用。
氨基酸是胎儿发育和生长的重要前体，为蛋白质、核苷酸和神经递质的生物合成提供来源。本研究发现蛋氨酸在生长受限儿中上调，此结果与在sIUGR[21]、单胎FGR[12]及体外实验[14]中的结论一致。蛋氨酸在为人体提供甲基后生成同型半胱氨酸，多项研究报道高同型半胱氨酸血症与胎儿生长受限有关[22-24]，高浓度的同型半胱氨酸可能会通过诱导过氧化氢和氧自由基的产生导致血管内皮细胞氧化损伤，绒毛血管数量减少，进而抑制胎盘血液灌注。高同型半胱氨酸水平可通过降低内皮细胞对精氨酸的转运进而降低内皮细胞释放一氧化氮(NO)[25-26]，而NO能够抑制胎盘血管内皮素I及血栓素A2来增加血循环量，进而增加营养物质供给[27]。精氨酸作为NO的前体，本研究显示其在生长受限儿中下调，推测可能在同型半胱氨酸的影响下，与胎盘内皮细胞对精氨酸的转运能力下降相关。此外，同型半胱氨酸还可以通过调节平滑肌细胞增殖和迁移影响胎盘血管的结构和功能，导致不良妊娠结局[28]。
本研究还观察到色氨酸的中间代谢产物犬尿酸在生长受限儿中低于正常胎儿，与Dunn[29]，Horgan[14]等人在合并有胎儿生长受限的胎盘组织中的发现一致。本研究发现色氨酸的另一个中间代谢物5-羟吲哚乙酸在生长受限儿脐血中下调，与子痫前期患者的血浆和尿液中浓度降低趋势一致[30]；子痫前期与FGR均为胎盘源性疾病，胎盘病理改变类似。FGR的胎盘功能不全，母体转运给胎儿的营养物质有限，不足以满足胎儿(尤其是大脑)对营养物质的消耗需求。色氨酸作为人体中重要神经递质5-羟色胺的前体，本研究显示色氨酸两条主要代谢途径中的犬尿酸及5-羟吲哚乙酸在生长受限儿中均下调，提示胎儿可能存在色氨酸缺乏或相关酶活性异常的情况；以及与自闭症关系密切相关的5-羟色胺合成障碍[31]，研究显示FGR胎儿发生自闭行为及社会和社会心理功能减退风险更高[32]。
本研究发现胆碱和磷脂类代谢物在生长受限儿中下调。胆碱是体内一种重要有机碱，神经递质乙酰胆碱和生物膜主要成分磷脂的前体，也可为各种甲基化反应提供甲基，在体内发挥重要作用。动物实验显示对胎盘功能受损的孕鼠补充日粮中胆碱，可增加胎鼠的体重[33]；细胞实验则证实胆碱可减低滋养细胞促炎、促凋及抗血管生成因子的丰度[34]，因此推测胆碱在胎儿及胎盘的生长发育方面发挥积极的作用。然而，在人群的研究中，结论尚不统一。来自西班牙的两项病例对照研究显示，与适于胎龄儿相比，胆碱在合并有FGR的胎儿脐血中水平更低[35-36]，与本研究结果一致。来自日本和荷兰[37-38]的研究则显示脐血胆碱浓度与出生体重负相关。另有研究显示脐血胆碱水平与胎儿体重并无关系[39-40]。不一致的结果可能与样本量、检测方法、人群构成或统计学方法有关，仍需更多的研究来确认。
对差异代谢物进行通路分析发现，代谢物主要影响半胱氨酸和蛋氨酸代谢、甜菜碱代谢、磷脂代谢、精胺生物合成等，提示这些代谢通路紊乱可能参与了胎儿生长受限的发生发展。其中，甜菜碱代谢与蛋氨酸代谢都参与一碳代谢，一碳代谢是体内主要甲基供体的来源，表观遗传可通过DNA甲基化、组蛋白的修饰等对基因表达进行调控，从而影响胎儿生长。
本研究应用代谢组学的方法筛选与DCDA双胎生长不一致有关的脐血差异代谢物，排除了外界因素和母体环境影响，有助于对FGR发生机制的理解。然而，研究尚存在不足之处：首先，本研究所采用的非靶向代谢组学技术仅为正离子模式，所获代谢组信息不够全面，无法覆盖有机酸等负离子模式优先检测的化合物，可能会遗漏对胎儿生长发育重要的小分子代谢物；其次，尚有部分脂质不能确定其具体代谢物名称，需通过标准品进一步验证。
目前尚不清楚双胎生长不一致的发生机制与代谢物的关系，胎盘作为母体和胎儿进行物质交换的器官，对于营养物质的转运起重要调控作用，弄清双胎妊娠胎盘如何调控营养物质的转运和分配将有利于探索生长不一致的发生机制，进而为临床干预，优化妊娠结局提供更多依据。
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