女性盆底功能障碍性疾病(pelvic floor dysfunction，PFD) 是一组由盆腔结缔组织的损伤、退化或功能缺陷所引起的盆底器官解剖结构及位置改变造成的妇科疾病，其中以性尿失禁(stress urinary incontinence，SUI)和盆底器官脱垂(pelvic organ prolapse，POP)最为常见，多发于中老年女性[1] 。盆底肌肉群、筋膜、韧带及其神经构成了复杂的盆底支持系统，其互相作用和支持，承托并保持子宫、膀胱和直肠等盆腔脏器于正常位置。胶原蛋白是韧带和筋膜等支持结构的主要成分，作为细胞支架，在细胞的黏附、生长、增殖方面，维持盆底支持组织的弹性和韧性起重要作用[2]。产后性功能障碍的发病率在不断升高，可高达70.6%[3]。中国中老年妇女人群中POP总体患病率约30% ，而美国60岁以上女性群体中POP患病率高达50%[4]，是影响女性身心健康和生活质量的重要公共卫生问题。 目前国内盆底功能障碍性疾病方面的研究较多但缺乏维族女性盆底组织中胶原蛋白结构和成分等特异性方面研究，本研究通过对比研究维族、汉族女性盆底功能障碍性疾病患者盆底组织中胶原蛋白 Ⅰ、Ⅲ 表达，了解 PFD的发生与不同民族之间有无差别，为PFD病因提供理论依据，并为其治疗提供新的方法和思路。
对象和方法
1. 研究对象：收集2017年12月—2018年12月在新疆维吾尔自治区人民医院妇科收治的PFD需手术治疗的维族患者和汉族患者各100例作为研究组，患者均无子宫肌瘤、子宫内膜异位症等雌激素相关疾病，均无类风湿性关节炎、甲状腺功能疾病等影响胶原含量与代谢的疾病等，均无阴道前、后壁修补等手术史。
2.实验方法：
(1)标本采集。所有患者均在术中切取阴道壁组织、骶主韧带组织约 0. 2 cm×0. 5 cm×0. 5 cm，标本及时保存在-80℃冰箱内。
(2)实验材料。TIANScript RT Kit 购自中国天根公司；SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)购自中国天根公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自中国Solarbio公司；Anti-Collagen Ⅰ抗体(ab138492)购自美国Abcam公司；Anti-Collagen Ⅲ抗体(ab7778)购自美国Abcam公司；Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(ab6721)购自美国Abcam公司；人Ⅰ型胶原(Col Ⅰ) ELISA试剂盒(购自美国Cusabio公司)；人Ⅰ型胶原(Col Ⅲ) ELISA试剂盒(购自美国Cusabio公司)。
(3)酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测血浆中Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ。采血针穿刺患者静脉，使用一次性医用真空EDTA-采血管采静脉血，将静脉血分装至2支采血管内，每支3 mL，在低速离心机上3000 r/min，离心半径13.5 cm，离心10 min，分离血浆，-80℃保存,ELISA法按照试剂说明书检测Collagen Ⅰ、Ⅲ表达水平。
(4)免疫组化实验方法来检测阴道壁组织和骶主韧带组织内Collagen Ⅰ、Ⅲ的蛋白表达情况。切片常规脱蜡水化，加3%H2O2室温处理10 min，在枸橼酸盐缓冲液(pH=6.0)中微波加热10 min(92～98 ℃)进行抗原修复，冷却后5%小牛血清室温处理10 min，分别滴加1∶100稀释的Collagen I兔多克隆抗体，1∶100稀释的兔单克隆抗体Collagen Ⅲ，4 ℃孵育过夜，再分别滴加1∶200稀释的羊抗鼠或羊抗兔二抗，室温处理30 min，再加SP(1∶100)工作液室温处理30 min，DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，封片后在显微镜下观察并摄片。
(5)RT-qPCR方法来检测阴道壁组织和骶主韧带组织内Collagen Ⅰ、Ⅲ的mRNA RT-qPCR。通过DNAMAN软件设计Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、GAPDH荧光实时定量PCR引物，并由上海生工有限公司合成。分别加入2ul 5×PrimeScript Buffer，0.5ul PrimeScript RT Enzyme Mix I，0.5 ul Oligo(dT)15(15μM)，0.5 ulRandom 6 mers(100μM)，Total RNA 500 ng，RNase Free dH2O达到10ul，混匀后短暂离心，在PCR仪上37 ℃温浴15 min，85 ℃加热5 s，稀释至35 μL，得到反转录的cDNA。qPCR反应：Forward primer 10 μM 0.8ul，0.8 ul Reverse primer 10μM，2XSYBR Select Master Mix(2×) 10ul，RNase-free water 6.4 ul，cDNA template 2ul，配制成20ul 体系混合均匀，在仪器上保持95 ℃，1 min，95 ℃，10 s，60 ℃ 34 s，40个循环，94 ℃ 1 min 30 s，60 ℃ 1min，60 ℃→94 ℃，1.1 ℃/s升温，从而获得qPCR反应结果。
3.统计学分析：所有数据采用均数±标准差
表示，利用SPSS 13.0软件进行数据处理，对计量资料进行单因素方差分析，采用LDS法进行两两比较，检验水准α=0.05，P<0.05为差异有显著性意义。
结果
1.研究对象一般特征：两组患者在年龄、绝经时间、妊娠及分娩次数、体质量指数等方面差异均无统计学意义(P>0.05)。
2.血浆中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的表达情况：Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ的ELISA结果均显示维族和汉族血浆中Collagen Ⅰ与Collagen Ⅲ表达有统计学意义(P<0.05)，汉族女性血浆中Collagen I的表达量为(137.84±30.99)ng/mL，维吾尔族女性血浆中Collagen Ⅰ的表达量为(200.00±66.54)ng/mL，差异有统计学意义(P<0.05)。汉族女性血浆中Collagen Ⅲ的表达量为(101.95±17.66)ng/mL，维吾尔族女性血浆中Collagen Ⅲ的表达量为(156.31±31.96)ng/mL。Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ在维族血浆中的表达显著高于汉族，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1A、1B。
表1 各组患者一般信息
组别样本量年龄(岁)绝经时间(年)妊娠(次)分娩次数(次)体质量指数(Kg/m2)维族10058.31±1.358.10±2.413.21±0.982.31±0.8727.51±3.66汉族10056.92±1.747.62±1.893.92±0.132.15±0.4226.92±2.91
图1 各组血浆中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的表达情况
3.维族及汉族阴道壁组织和骶主韧带组织内Collagen Ⅰ、Ⅲ的蛋白表达情况：
维族女性阴道壁组织中Collagen Ⅰ的蛋白表达量为(0.05±0.002)，汉族女性阴道壁组织中Collagen Ⅰ的蛋白表达量为(0.07±0.005)，差异有统计学意义(P<0.05)。
维族女性阴道壁组织中Collagen Ⅲ的蛋白表达量为(0.05±0.004)，汉族女性阴道壁组织中Collagen Ⅰ的蛋白表达量为(0.03±0.006)，差异有统计学意义(P<0.05)。维族女性骶主韧带组织中Collagen Ⅲ的蛋白表达量为(0.03±0.008)，汉族女性骶主韧带组织中Collagen I的蛋白表达量为(0.04±0.01)，差异有统计学意义，P<0.05。
维族骶主韧带组织和汉族骶主韧带组织无明显差异性，P>0.05，详见图2A-2B。
*P<0.05
图2 不同民族阴道壁和骶主韧带中Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ的蛋白表达情况
4.Collagen Ⅰ、Ⅲ mRNA表达差异性：
骶主韧带组织和阴道壁组织内Collagen Ⅰ，Collagen Ⅲ的mRNA表达结果有差异。维族女性阴道壁组织中Collagen Ⅲ的mRNA表达量为(0.52±0.10)，汉族女性阴道壁组织中Collagen Ⅰ的mRNA表达量为(0.19±0.04)，差异有统计学意义(P<0.05)。
维族女性骶主韧带组织中Collagen Ⅰ的mRNA表达量为(0.28±0.46)，汉族女性骶主韧带组织中Collagen Ⅰ的mRNA表达量为(2.29±0.24)，差异有统计学意义(P<0.05)。
维族女性骶主韧带组织中Collagen Ⅲ的mRNA表达量为(0.36±0.07)，汉族女性骶主韧带组织中Collagen Ⅲ的mRNA表达量为(1.39±0.07)，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。
*P<0.05
图3 图3 各组组织中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ mRNA的表达情况
讨论
盆底支持组织主要由肌肉群和结缔组织构成，其支持和稳定功能主要取决于细胞外基质中不同类型纤维间的相互作用，主要包括胶原蛋白、蛋白聚糖、弹性蛋白、层黏连蛋白和纤连蛋白，其中胶原蛋白是主要蛋白质成分，占全部蛋白25%以上[5]。胶原是有由3条a多肤链联构成三股螺旋结构，而每条a链由近1 000个氨基酸组成，其长为300 mm。细胞外基质大体可分为胶原蛋白、蛋白多糖、糖蛋白3大类。从而构成可胶原稳定的蛋白分前胶原是细胞内合成后分泌到细胞外的，在细胞外形成胶原，进而通自身募集形成胶原纤维以及纤维束，并决定了组织的一定形状级生物行为。组织的韧性及强度与胶原的成熟性与化学特性有关。目前已发现数十种胶原，由不同基因编码而成。不同的胶原蛋白有不同的化学结构及免疫学特性，其中Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白为主构成盆底组织，Ⅰ型胶原直径粗，硬度大，主要分布于皮肤、肌肉、骨骼、韧带等组织，起支持作用；Ⅲ型胶原直径细，弹性大，主要调控组织弹性[6-8]。
有研究表明，不同民族女性PFD的患病率具有差异性[9]，但尚无关于Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ在维吾尔族和汉族女性PFD之间的相关研究本次实验ELISA结果显示，维族胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ型表达量明显高于汉族。
本研究发现Collgen I和Collagen Ⅲ的基因和蛋白在组织中存在差异性，表明PFD主要发生点仍在组织内，而非游离蛋白状态决定。在基因水平上，维族患者阴道壁组织内Collagen Ⅰ表达量远远高于汉族，维族骶主韧带组织Collagen Ⅲ表达量远远低于汉族，说明在不同民族患者内，维族阴道壁组织强度高于汉族，而主韧带组织弹性小于汉族，表明在不同民族患者内的盆底功能障碍性疾起因是不同的，汉族可能为阴道壁组织强度降低，维族为主韧带组织弹性降低，均会引起组织弹性降低，脆性增加，易于断裂，使盆底器组织对盆腔器官的支撑作用明显减弱，从而导致PFD[10-11]。在蛋白水平上，维族患者阴道壁组织内Collagen Ⅰ表达量远远高于汉族，与转录组水平一致；维族骶主韧带组织Collagen Ⅲ表达量远远高于汉族，与转录组水平相反；故考虑维族骶主韧带组织中前胶原蛋白可以过转化为胶原蛋白III型，或者胶原酶活性降低或胶原酶含量低导致胶原蛋白降解减少所致[12]。
随着分子生物学的发展、基因遗传及变异在盆底功能障碍性疾病中的作用日益受到医学界研究人员的重视，本研究发现Collagen Ⅰ、Ⅲ的在维吾尔族和汉族之间的差异性可能是由基因易感性和外界环境问题的共同因素导致，国外一项PFD 家系研究显示：126名家族性POP 患者中71%伴有SUI，54%伴有OAB，183名家族性 SUI患者中59 %合并POP，60%合并OAB，而101位家族性 OAB患者中 SUI 及 POP 的发生率分别为88%和66%，提示遗传因素在 PFD发病过程中的作用不容忽视[13]。瑞典学者 Altman 等[14]在开展了一项大样本量队列研究发现，同卵双生子之间患病情况的相似度显著高于异卵双生子，提示遗传效应影响 SUI和 POP的发病; 进一步分析显示，遗传效应和特异环境因素对总变异的贡献各占40%左右，非特异性的环境因素贡献约20%的总变异，提示环境因素的影响在 SUI /POP 的发病中占主导作用。相关研究[15]表明胶原蛋白调控合成基因的基因多态性与PFD之间存在相关性，miR-196a-2、miR-146a、miR-149等的基因编码区多态性差异即可影响胶原蛋白形成，导致不同民族人群PFD的发生风险不同。同时新疆地区维吾尔族的生活方式、饮食习惯也会起到一定的影响作用。因此，也可能会造成胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ型的不同表达，本研究样本量较少，需要今后进一步研究更加明确。
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