精子优选技术作为辅助生殖技术的重要环节之一，与妊娠结局有着密切的联系。研究发现，男性精液中DNA损伤精子仍具有受精能力，但却影响受精后的胚胎发育潜能或导致胚胎发育的异常[1]。因此，通过精子优选技术去除杂质、碎片和冷冻保存液，获得高前向运动活力、高细胞形态正常以及高DNA完整率、少损伤、无凋亡的精子的精子悬液是提高辅助生殖技术(assisted reproduction technique，ART)成功率和安全性的重要保障。磁性活性细胞分选法(magnetic activated cell sorting，MACS)作为新兴的精子优选技术，其原理是通过膜联蛋白V偶联的磁珠特异性结合磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)外翻(凋亡)的精子，在磁场的作用下筛选出未凋亡的精子[2]。本文通过研究MACS对新鲜精液与冷冻精液的优选效果，从精子前向运动活动率(PR%)、DNA完整率等多个方面探讨对其优化效果进行评价，为临床广泛应用MACS优选精子提供可靠的实验室数据支持。
对象与方法
1.研究对象：在北京地区招募科研志愿者，签订知情同意书后留取精液。科研志愿者入选条件为成年男性，年龄20～45周岁，身体健康，无传染性疾病且精液质量符合《世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册》(第5版)[3](简称：WHO5手册)健康人群标准，精子浓度≥15×106/mL，PR%≥32%。
2.实验仪器及试剂：miniMACS starting kit和Dead cell removal kit购于德国美天旎生物技术有限公司；精子DNA碎片检测试剂盒(SCD法)和精子活体染色(伊红-苯胺黑染色法)试剂盒购于博锐德生物科技有限公司；QUINNS Sperm Wash Medium(ART-1006)购于秒泉仪器有限公司；生物显微镜(奥林巴斯CX41，日本)。
3.研究方法：
(1)分组。收集20例健康男性精液，精液完全液化后分为两份，每份1 mL精液，设置两个实验组，一组做新鲜精液的MACS优化(新鲜精液组)，一组制备为冷冻精液，解冻后进行冷冻精液的MACS优化(冷冻精液组)。记录每份精液优选处理前后的精子浓度、前向运动精子活动率、膜完整性、正常形态率及DNA碎片率。
(2)新鲜精液标本优化前预处理。科研志愿者禁欲2～7 d，通过手淫法获取精液至无菌容器内，将该容器置于37℃水浴锅中液化30 min，待精液全部液化后吸取1 mL精液样本进行项目研究。
(3)冷冻精液标本的制备及优化前预处理。①冷冻精液标本制备。精液标本完全液化后，精液和甘油-卵黄-柠檬酸盐冷冻保护剂以2∶1的比例混匀，30℃平衡10 min后，将冷冻管置于液氮面悬挂熏蒸10 min，最后浸入液氮内保存。
②冷冻精液优化前预处理。从液氮中提取精液冷冻管，放置于37℃水浴锅内进行解冻，待精液样本完全解冻后进行项目研究。
(4)磁珠活性细胞分选法(MACS)。测定精液样本优化前各项参数后，取1 mL精液样本，按照精液浓度每10×106个精子加入80 μL 1×结合缓冲液和20 uL MACS Annexin V磁珠，混匀后室温孵育15 min，使用ART-1006进行洗涤，离心后去上清，加入1×结合缓冲液重悬精子沉淀，将精子悬液置于磁场分选柱中，用1×结合缓冲液冲洗分选柱，重复3次，收集冲洗液，冲洗液离心后去上清，加入0.5 mL ART-1006重悬精子沉淀。最后置37 ℃温箱内进行各项参数的检测。
(5)精液动态学检测。参考WHO5手册[3]标准对精液进行计数，并根据活力分为前向运动、非前向运动和不运动三个等级，计算前向运动精子总数占总精子数的百分比，得出前向运动精子活动率(PR%)。由于在自然受孕中使卵子受精的大部分为前向运动精子，故在辅助生殖实验室里常使用PR%来评估精子质量。
(6)精子形态学检测。使用WHO5手册[3]推荐形态学染色方法(巴氏染色法)对精子进行涂片染色，镜下观察至少200个精子，判断是否畸形，计算正常精子占总精子数的百分比，得出精子正常形态率。
(7)精子细胞膜完整性检测。利用精子活体染色法(伊红-苯胺黑染色法)对精子进行涂片染色。若精子细胞膜不完整，则头部染为红色或暗粉色；若完整，头部为白色或淡粉色。40倍镜下观察至少200个精子，计算细胞膜完整的精子占总精子数的百分比，得出精子细胞膜完整率。
(8) 精子DNA完整性检测。使用精子染色质扩散法(Sperm Chromatin Dispersion，SCD)。检测精子DNA完整性，40倍镜下观察至少500个精子，根据精子头部光晕大小判断该精子是否含有DNA碎片的精子(图1)，计算DNA完整的精子占总精子数的百分比，得出精子DNA完整率。
①：为精子DNA碎片判定图示，其中A为精子头部最小直径，B为单侧光晕厚度，当B≤1/3 A则表明精子存在DNA碎片；②、③：DNA完整的精子；④、⑤：存在DNA碎片的精子
图1 精子DNA完整性判断示意图(瑞士染色，×40)
4.统计学处理：采用t检验对结果进行统计学分析，P<0.05表示差异有统计学意义。
结果
1.新鲜精液和冷冻精液优化前后前向运动精子活动率比较:通过MACS优化后，新鲜精液组和冷冻精液组PR%无显著性差异(P>0.05)，但冷冻精液组优化后PR%低于优化前，见表1。
表1 MACS优选前后PR比较
组别例数PR(%)优选前优选后新鲜精液组2056.29±12.9465.21±14.55冷冻精液组2034.13±17.0122.71±13.51
2.新鲜精液和冷冻精液优化前后形态学变化:新鲜精液组和冷冻精液组精液经MACS优化后，正常形态率、精子膜完整率、DNA完整率均得到优化，优选前后差异均有统计学意义，其中MACS对新鲜精液组膜完整性和冷冻精液组DNA完整性的优化效果差异显著(P<0.01)。见表2、图2。
表2 MACS优选前后精子各项形态参数对比
与同组优选前相比，*P<0.05，**P<0.01
组别例数正常形态率(%)优选前优选后膜完整性(%)优选前优选后DNA完整率(%)优选前优选后新鲜精液组2016.78±3.5725.78±1.95*59.11±10.0782.86±4.46**68.93±9.685.44±5.62*冷冻精液组207.90±3.8013.72±4.58*69.21±7.7984.00±5.33*69.79±3.991.95±2.82**
①：新鲜精液组(优选前)；②：新鲜精液组(优化后);③：冷冻精液组(优化前)；④：冷冻精液组(优化后)
图2 优选前后精子DNA完整性(瑞士染色，×40)
讨论
近年来，不孕不育症逐渐成为影响人类健康和发展的一个全球性医学和社会学问题。自1978年首例“试管婴儿”的诞生,ART开始进入人们的视线，并且因为其安全、高效以及质量保证，受到患者的信赖。精子优选技术作为辅助生殖领域中保障其质量重要的环节之一，与妊娠结局有着密切的联系。
研究表明，精子DNA完整性是正常受精、着床和胚胎发育的必要条件[4]，精子DNA碎片 (Sperm DNA Fragmentation，DFI)会影响自精和供精体外受精(in vitro fertilization，IVF)和卵胞质内单精子注射技术(Intracytoplasmic sperm injection，ICSI)的受精、卵裂、胚胎质量、胚胎种植和临床妊娠结果[5-6]。所以精子优选技术不仅需要去除精液中的杂质，提高前向运动精子活动率以及细胞形态正常率，更要提高精子DNA完整性，从而保障精液质量，改善妊娠结局。MACS作为新兴的精子优选技术，可以很好的去除凋亡精子，显著提高DNA完整率。本研究通过MACS对新鲜和冷冻精液优化效果进行研究，从多方面尤其是DNA完整率方面对其进行评价，为临床广泛应用MACS优选精子提供可靠的实验室数据。
本研究结果显示，MACS可通过筛选细胞膜上PS外翻的精子，优化新鲜和冷冻精液的正常精子形态率、膜完整性和DNA完整率(P<0.05)，对于新鲜精液组的膜完整性和冷冻精液组的DNA完整性的优化效果差异显著(P<0.01)。这表明MACS可有效去除畸形精子、凋亡精子，获得高DNA完整率的精液，其结果与以往对新鲜精液优化的MACS研究结果基本一致[7-8]。值得注意的是精子畸形包括存在头部、中段、主段等类型，本研究MACS对新鲜精液和冷冻精液组进行优化后，其正常形态率也只达到(25.78±1.95)%和(13.72±4.58)%，这表明在经过MACS优化的精液中畸形精子仍然占有很大的百分比；在改善精液前向运动率方面，MACS不能显著改善新鲜精液的前向运动率(P>0.05)，且冷冻精液的前向运动率不仅没有得到改善，反而降低。推测在新鲜和冷冻精液中都存在细胞膜和DNA完整但运动活力差或没有运动活力的精子，MACS无法有效去除此类精子，因此不能显著提高精子的前向运动活动率，且精子受冷冻的影响，可能存在细胞膜和DNA完整却丧失了活动的动力的现象，故冷冻精子经MACS优化后，其精子前向运动活动率反而降低。综上所述，MACS可以很好的优化新鲜和冷冻精液的正常精子形态率、膜完整性和DNA完整率，在IVF和ICSI中有很高的应用价值，但MACS不能显著提高精子前向运动活动率，故在自精和供精人工授精(artificial insemination，AI)的应用中存在局限性。
细胞膜上PS外翻是细胞早期凋亡的特征之一，先于DNA碎片化[2]。虽然MACS不能很好的提高精液的前向运动活率，但MACS可以筛选出细胞膜PS未外翻的未凋亡精子，有效消除DNA碎片化的精子，保障胚胎发育潜能，改善ART夫妇的生殖结局[9]。研究表明，MACS对比密度梯度离心法 (density-gradient centrifugation，DGC)对于IVF的临床结果无差异，但有助于选择最具生育能力的精子，显著改善ICSI受精周期中临床结局[10-11]。另外，也有学者将MACS与DGC相结合优选精子，结果显示，MACS-DGC可以显著提高精子质量，在改善精子DNA完整性的同时提高前向运动活率[12-13]。在临床研究方面，早在2010年就有利用MACS优选新鲜精子后行ICSI成功妊娠分娩健康婴儿的报道[14]，并逐渐应用到Kartagener综合征等男性不育症的辅助生殖治疗[15]。
MACS在辅助生殖领域有广泛的应用前景和临床研究价值，本文中使用了20名志愿者的精液标本，样本量偏少，仅分析比较精液相关质量参数，缺乏后期临床试验，如比较受精率、优胚率及妊娠率等情况。MACS在辅助生殖领域的推广仍需更多的样本量以及更多全面的研究才能得以实现。
1 Seli E,Gardner D K,Schoolcraft W B,et al.Extent of nuclear DNA damage in ejaculated spermatozoa impacts on blastocyst development after in vitro fertilization.Fertil Steril,2004,82:378-383.
2 Glander HJ,Schaller J.Binding of annexin V to plasma membranes of human spermatozoa:a rapid assay for detection of membrane changes after cryostorage.Mol Hum Rep,1999,5:109-115.
3 谷翊群.世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册.北京:人民卫生出版社,2011.
4 武健,李立鹏,曹金凤.精子DNA碎片检测在辅助生殖中的研究进展.检验医学与临床,2020,17:3216-3220.
5 Zini A,Boman JM,Belzile E,et al.Sperm DNA damage is associated with an increased risk of pregnancy loss after IVF and ICSI:systematic review and meta-analysis.Hum Rep,2008,23:2663-2668.
6 毛太峰,戎春浩,罗琼秀,等.精子DNA碎片指数对精子优化处理后IUI临床结局的影响.中华男科学杂志,2019,25:88-91.
7 Zhang H,Xuan X,Yang S,et al.Selection of viable human spermatozoa with low levels of DNA fragmentationfrom an immotile population using density gradient centrifugation and magnetic-activated cell sorting.Andrologia,2018,50:1-7.
8 Martínez MG,Sánchez-Martín P,Dorado-Silva M,et al.Magnetic-activated cell sorting is not completely effective at reducing sperm DNA fragmentation.J Assist Reprod Genet,2018,35 :2215-2221.
9 Pacheco A,Blanco A,Bronet F,et al.Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS):A Useful Sperm-Selection Technique in Cases of High Levels of Sperm DNA Fragmentation.J Clin Med,2020,9:3976.
10 Fang L,Ye YH,Li ES et al.Magnetic-activated cell sorting (MACS) versus density gradient centrifugation (DGC) for the selection of human sperm in assisted reproductivetechniques..Zhonghua Yi Xue Za Zhi,2018,98 :3263-3267.
11 江伟杰,金帆,周黎明.精液优化处理后DNA碎片指数、精子畸形率与IVF胚胎发育、早期自然流产的相关性.中华男科学杂志,2016,22:520-524.
12 邓雪连,吕福通,莫毅,等.应用DGC结合MACS技术优选精子的效果评价.中国妇幼保健,2014,29:564-566.
13 Berteli TS,Da Broi MG,Martins WP,et al.Magnetic-activated cell sorting before density gradient centrifugation improves recovery of high-quality spermatozoa.Andrology,2017,5 :776-782.
14 Rawe VY,Boudri HU,Sedó CA,et al.Healthy baby born after reduction of sperm DNA fragmentation using cell sorting before ICSI.Reprod Biomed Online,2010,20:320-323.
15 Cla B,Apa B,Msca B,et al.Healthy baby born after ICSI with ejaculated immotile spermatozoa from a male Kartagener syndrome using Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) as a compliment of sperm preparation technique:A case report.MEDRE,2020,7:98-106.