双酚A(bisphenol A，BPA)是一种广泛应用于工业生产的增塑剂，已有多种证据表明BPA是一种环境内分泌干扰物(endocrine disrupting chemicals, EDCs)，可影响女性生殖功能[1]。HOXA10是子宫内膜蜕膜化的标志基因，HOXA10基因缺失的小鼠因蜕膜化缺陷导致胚胎着床失败而出现反复妊娠流产[2]。HOXA10的启动子区域有多个可以与ERα结合的雌激素反应原件(estrogen response element, ERE)。雌激素受体ERα作为HOXA10的转录因子直接调控HOXA10的表达，但ERα对HOXA10的转录调控作用受多种因素的影响[3]。课题组前期初步研究发现BPA影响混合谱系白血病组基因MLL1及子宫内膜蜕膜化相关基因的表达[4-5]，但尚不清楚在子宫内膜间质细胞蜕膜化过程中，BPA是否通过调控MLL1的表达，进而影响MLL1与ERα的结合及其对ERα靶基因HOXA10的转录激活作用。为验证MLL1在BPA调控HOXA10表达中的关键作用，将进一步探讨不同BPA浓度暴露影响蜕膜化分子标志物HOXA10表达的具体分子机制。
资料与方法
一、实验室资料
1.细胞培养：永生化的人子宫内膜基质细胞系(HESCs)从美国典型培养物保藏中心(ATCC，Cat#CRL-4003)获得，细胞用含有10%活性炭处理胎牛血清(CS-FBS)的无酚红DMEM/F12(Procell，PM150316)培养基在37 ℃与5%CO2条件下培养。
2.体外蜕膜化及双酚A暴露:HESCs在完全培养基中培养至达到70%～80%，在2%CS-FBS培养基中饥饿24小时。向培养基中加入10 nM 雌二醇(E2，Sigma)、1μM甲羟孕酮(MPA，Sigma)、0.5 mM环状单磷酸腺苷(cAMP，Sigma)和不同剂量(分别为0，10 pM，10 nM，10μM；选择人群中普遍暴露的BPA浓度，即环境相关的浓度10nM，以及低剂量组10pM和高剂量组10μM进行实验。)的双酚A(BPA，Sigma)的2%CS-FBS培养基处理，每隔一天更换一次培养基，蜕膜化处理6 d后收获细胞进行后续实验[4-5]。
3.细胞增殖测定：取HESC对数生长期的单层贴壁细胞，0.25%胰酶消化，1000 r/min, 5min后离心收集细胞，以1.0×103/孔的密度植入于96孔板中，每组5个复孔，于37 ℃，5%CO2培养箱中培养。细胞贴壁后，培养6天时每孔分别加入10 μL的CCK8溶液，细胞培养箱中继续培养2 h，酶标仪测定450 nm的光密度值。相对增殖速率=ODBPA组/OD溶剂组×100%。
4.RNA提取和实时定量PCR：使用RNA提取试剂盒从细胞中提取总RNA，然后用HisScript II Q RT SuperMix(Vazyme)，将样品中1 μg RNA逆转录合成cDNA用于qPCR。ChamQTMSYBR qPCR预混液(Vazyme)在CFX Connect Real-time PCR系统上进行定量实时PCR(qPCR)。qPCR的引物序列示于表1。mRNA的表达水平归一化至GAPDH，使用2-ΔΔ Çt方法进行分析。
5.蛋白印迹实验：用RIPA裂解缓冲液(Beyotime)裂解不同组的细胞，所得蛋白裂解物用BCA蛋白检测试剂盒测定其蛋白质浓度。用10%SDS-PAGE凝胶分离等量的蛋白质后转移到PVDF膜上，用5%的脱脂牛奶封闭2 h。将膜分别与兔抗MLL1抗体(1:1 000; Bethyl, 货号A300-374A)，小鼠抗HOXA10抗体(1:500; Santa Cruz, 货号AB_10649855)，小鼠抗GAPDH(1:6 000, Proteintech, 货号AB_2107436)。TBST洗涤后与相应的过氧化物酶偶联的二抗在室温下孵育1小时。使用高灵敏度ECL化学发光检测试剂盒经ECL发光成像系统(Tanon, 上海)进行检测，使用Image J对条带强度进行量化。
6.免疫共沉淀(CoIP)：按照免疫沉淀试剂盒(Sangon Biotech)制造商的说明，进行CoIP。将细胞在超声条件下1×裂解缓冲液中裂解，将等量的蛋白质用于免疫沉淀。加入适量的目的基因的抗体和非特异性IgG，并在4℃下孵育过夜。将混合液添加到18μLProtein A/G-琼脂糖柱中，在4℃下孵育过夜。用IP缓冲液洗涤几次后，用1×上样缓冲液将结合的蛋白洗脱，最后通过SDS-PAGE凝胶电泳进行分析，用于免疫印迹的抗体是抗ERα的兔抗体(稀释度1:1 000; abcam)，兔抗MLL1抗体(稀释度1:1 000; Bethyl, A300-374A)。
7.染色质免疫共沉淀(ChIP)：按照CST公司的ChIP试剂盒(#56383)说明操作：先用1%甲醛将DNA结合蛋白与DNA交联，甘氨酸终止交联；超声下裂解细胞，剪切染色质；取出2%输入对照样品；用MLL1抗体、IgG抗体与含DNA的染色质相结合，并加入Protein G磁珠使其沉淀下来，多次洗涤沉淀物；通过解交联去除结合的蛋白质纯化DNA；以得到的DNA为模板对HOXA10启动子上多个ERE进行RT-PCR扩增，引物序列见表1。
表1 用于RT-PCR，ChIP的引物列表
Table 1 List of primers used for RT-PCR andChIP
基因名称 引物序列MLL1FGCATCCTGGGCTACACTGAGRCCACCACCCTGTTGCTGTAGHOXA10FTTCCAAAGGTGAAAACGCAGRCACTTGTCTGTCCGTGAGGTGAPDHFATCCCATCACCATCTTCCAGRATGAGTCCTTCCACGATACCPRLFTCTCGCCTTTCTGCTTATTATAACCRGATTCGGCACTTCAGGAGCTTIGFBP-1FCTATGATGGCTCGAAGGCTCRTTCTTGTTGCAGTTTGGCAGERE1FGGATCAACGGACTAGGGGAGARCCTCAAAAGTGGCGAACCTGERE2FACGGACTAGGGGAGAAAAGTGRCCAGGAGACGCACCCCGACA
二、统计方法：每组实验至少重复3次以上，使用GraphPad Prism 8程序进行统计分析。所有值均显示为平均值±标准差
两组之间的比较使用Student t检验进行，多组之间的差异通过单因素方差分析，P值小于0.05时表明差异具有统计学意义。
结 果
一、不同浓度BPA对HESC细胞增殖的影响
CCK-8实验表明10 pM和10 nM的BPA暴露后，HESC细胞的增值能力并没有降低，反而稍微升高。但BPA浓度为10 μM时，细胞的增殖能力与溶剂组无显著差别(图1)。以上结果表明，BPA可能以非线性方式影响HESC细胞的增殖，且这三种浓度的BPA均不会对HESC细胞增殖造成损伤。
Note：Data are from four independent experiments.Veh=Vehicle, 10 pM、10 nM、10 μM indicate the concentration of BPA, *P<0.05 vs Vehicle
图1 不同浓度BPA对HESC细胞增殖的影响
Figure 1 The effect of different concentrations of BPA on the proliferation of HESC cells
二、BPA暴露对蜕膜化过程中HESCs细胞MLL1、HOXA10表达的影响
蜕膜化处理的细胞中蜕膜化标志物IGFBP1和PRL的mRNA含量显著升高(图2A)，表明体外蜕膜化模型成功建立。不同浓度BPA(0、10pM、10nM、10μM)暴露后，蜕膜化细胞中的MLL1和HOXA10 mRNA的表达水平降低，在10nM和10μM处差异具有显著性(图2B)，Western Blot结果与qPCR一致(图2C)。
Note:Figure A shows RT-qPCR analysis of IGFBP-1 and PRL mRNA levels after decidualization treatment; Figure B shows RT-qPCR analysis of MLL1 and HOXA10 mRNA levels after BPA treatment.expression of in BPA concentration.Figure C shows Westernblot analysis of MLL1 and HOXA10 protein levels after BPA treatment.expression of in BPA concentration.Data are from four independent experiments; NC=normal control, Dec=decidualization, *P<0.05 vs NC or Veh
图2 BPA暴露对蜕膜化HESCs中MLL1和HOXA10的mRNA及蛋白表达的影响
Figure 2 The effect of BPA exposure on the mRNA and protein expression of MLL1 and HOXA10 in decidualized HESCs
三、不同浓度BPA暴露后MLL1与ERα的结合情况
为了探讨MLL1是否为ERα的共结合因子，通过用ERα和MLL1抗体进行双向CoIP实验，以MLL1抗体进行IP时，随着BPA浓度的升高ERα与MLL1的结合降低，同样的，以ERα的抗体进行IP时也得到了同样的结果，该结果也说明了MLL1与ERα为调控蜕膜化的共作用因子，且BPA的暴露会降低二者的结合(图3)。
Note:the picture shows the representative protein bands from the three experiments, Input = input control, IP = immunoprecipitation
图3 不同浓度BPA暴露后MLL1与ERα的结合情况
Figure 3 The binding of MLL1 and ERα after exposure to different concentrations of BPA
四、MLL1、ERα共作用因子在HOXA10启动子区的富集情况
HOXA10启动子在转录起始位点上游的前3000个核苷酸内包含多个雌激素反应元件,包括ERE1和ERE2(图4A)，通过进行ChIP实验发现MLL1、ERα共作用因子在ERE1、ERE2区域均有富集。与溶剂组比较，ERE1处富集效率在10 nM时下降了约54%，10 μM时下降了约57%，ERE2处富集效率在10 nM时下降了约47%，10 μM时下降了约52%，差异具有显著性(图4B)。
Note:Figure A shows schematic diagram of ERE1 and ERE2 in the HOXA10 promoter, TSS = transcription start site; Figure B shows enrichment of MLL1 and ERα cofactor in ERE1 and ERE2 regions, data are from three independent experiments, IgG as a negative control group, *P<0.05 vs Veh
图4 MLL1、ERα共作用因子在ERE1、ERE2区域富集情况
Figure 4 Enrichment of MLL1 and ERα cofactor in ERE1 and ERE2 regions
讨 论
BPA用于合成聚碳酸酯和环氧树脂等材料。BPA可使材料透明度高、防冲击、耐用轻巧、耐热防腐蚀，常用于制造矿泉水瓶、食品包装、光盘等产品，是世界上产量最高的化学品之一，年产量高达100亿千克，每年大约有100吨BPA释放到大气中[6]。流行病学资料显示，在95%的人群尿液样本中检测到BPA，浓度≥0.1 ng/mL(0.44 nM)[7]，对成人血液样本进行分析发现人体血液内BPA浓度范围为0.2～10 ng/mL(0.9～44 nmol/L)[8]。BPA可以在正常使用条件下从塑料制品中浸出，通过消化道、呼吸和皮肤接触而进入人体，进入人体后的BPA会被输送到肝脏进行迅速的“首过代谢”，生成无活性的结合双酚A，这一过程显著降低了血液中的双酚A浓度，但研究表明未结合的双酚A仍旧可以在循环中保持数小时甚至数天[9]。对成人血液样本进行分析后发现，生物活性形式的非结合型BPA在血液中平均浓度为1～3 ng/mL(4～13 nmol/L)[3]。在本次实验中我们选择10 pM、10 nM、10 μM三种的浓度来进行研究，其中10 pM和10 nM为环境相关的浓度，10 μM则代表了高暴露人群人体组织中的双酚A浓度，三个浓度对子宫内膜基质细胞的增殖均没有损害(图1)。BPA对蜕膜化的影响近年来一直受到国内外学者所关注，在子宫内膜异位症等蜕膜化损伤相关疾病的患者体内血清BPA浓度较高。Mark等发现BPA在10 μg/mL(43.8 μM)和20 μg/mL(87.6 μM)时会对蜕膜化造成损伤，但在较低剂量下则不会[10]，Aghajanova L也发现50 μmol/L和100 μmol/L的高浓度BPA会对蜕膜化造成损伤[11]，但这些研究中BPA的浓度远远高于在人群中可以检测到的浓度。此外，BPA 对子宫内膜蜕膜化影响的研究结果也不一致。Mannelli等人[12]先对子宫内膜间质细胞进行蜕膜化处理，再将其暴露于BPA(1 μM、1 nM、1 pM)24 h，发现 1 μM的BPA可降低PRLmRNA的表达。Forte等人[13]发现当子宫内膜间质细胞单独给予BPA处理或者孕酮处理24 h之后给予 BPA 暴露(10 uM、10 nM、10 pM)，都会使 PRL和IGFBP-1mRNA 的表达不同程度的升高。这些研究结果的差异可能是由于药物种类、给药方式或药物刺激时间的不同而造成的。由于“低剂量效应”的概念逐渐被认为是EDCs影响人体健康的一大普遍特征,更多的研究开始关注于低浓度的EDCs对疾病的影响[14]。本实验结果表明子宫内膜基质细胞在给予cAMP、MPA、E2蜕膜化处理，并同时暴露于10 nM和10 μM BPA时会使细胞内HOXA10表达降低(图2)，这也就意味着BPA对蜕膜化的影响不仅是在高浓度下，在较低的环境相关的浓度下，BPA也会对蜕膜化造成损害，验证了BPA的“低剂量效应”。
本课题前期研究发现BPA影响子宫内膜间质细胞蜕膜化及其分子标志物的表达，但具体分子调控机制尚不明确[4]。HOXA10是子宫内膜蜕膜化的标志基因，HOXA10基因缺失的小鼠因蜕膜化缺陷导致胚胎着床失败而出现反复妊娠流产[2]。混合谱系白血病组基因MLLs是人类组蛋白甲基化转移酶，包括MLL1、MLL2、MLL3、MLL4、SET1A和SET1B等，它们的作用是催化组蛋白H3K4的甲基化，促进靶基因的转录激活。MLL1蛋白分子上有与ERα结合的结构，可作为ERα的共同作用因子，参与对ERα下游靶基因的转录调控[15]。HOXA10是一种转录调节基因，在胚胎植入过程中起着重要作用，Nancy Ashary等研究认为HOXA10在胚胎植入过程中有三个重要作用：获得子宫内膜的容受性；响应来自胚泡的信号，使子宫内膜蜕膜化；促进滋养细胞的侵袭和胎盘形成[16]。近年来，HOXA10的下游效应机制[17]以及上游调控机制[18]引起了大家的关注，这些研究不仅说明了HOXA10在蜕膜化过程中扮演着重要角色，也提示明确蜕膜化中HOXA10的上下游相关机制的必要性。MLL1是一种H3K4组蛋白赖氨酸甲基转移酶，H3K4的甲基化已被证明与多种真核生物的转录激活相关，参与多种生物功能，对全基因组组蛋白修饰的研究发现H3K4的甲基化参与调控子宫内膜蜕膜化相关基因的表达变化[19]。以女性蜕膜化损伤为特征的习惯性流产的患者子宫内膜中MLL1表达水平显著降低[9]。由MLL1组成的H3K4甲基转移酶复合物是HOX基因激活所必需的，在细胞周期调控中，HOX基因(HOXA5、HOXA7、HOXA10)可招募MLL1蛋白到HOXA基因的启动子序列上，引起H3K4组蛋白甲基化修饰和HOXA基因的转录激活[20]。另有研究提示在急性髓性白血病中，MLL1是ERα的共作用分子，ERα可结合MLL1蛋白，促进MLL1 结合到HOXA10启动子上来调控HOXA10的表达[21]，在子宫内膜蜕膜化过程中，可能也存在类似的分子作用机制。本研究的结果发现在蜕膜化的过程中，MLL1确实会与ERα结合，并作为其共同作用因子调控HOXA10表达，且BPA的暴露减少MLL1与ERα的结合(图3)，不仅如此，MLL1和ERα在HOXA10的启动子区ERE的富集也与浓度呈逆相关(图4)。总之，环境浓度BPA和高浓度BPA暴露使MLL1和ERα对靶基因HOXA10的转录调控作用减弱，最终导致HOXA10 表达降低，影响子宫内膜蜕膜化。这为探索BPA暴露影响子宫内膜蜕膜化分子标志物表达的机制提供了新的研究思路，也提示MLL1作为ERα的共同作用因子可能还调控其它蜕膜化相关基因的表达。BPA本身也具有拟雌激素作用，可直接与ERα结合进而调控HOXA10，故BPA可直接影响或通过MLL1相关机制间接影响蜕膜化。
子宫内膜间质的蜕膜化对子宫内膜容受性的建立起重要作用，而子宫内膜容受性的建立又是胚胎成功着床的必要条件，因此揭开蜕膜化损害所涉及的分子机制一直是生殖医学领域的研究主题。课题组前期实验通过使用MLL1的抑制剂和siRNA证明MLL1在蜕膜化中起重要作用[9]，并发现BPA对蜕膜化造成损害可能与MLL1有关[5]，而本文则发现BPA是通过降低MLL1和ERα共作用因子的结合并减少其在HOXA10启动子区的富集从而减少HOXA10的表达，对蜕膜化造成损伤。该发现有助于加深对BPA影响子宫内膜蜕膜化分子机制的了解，并引起人们对BPA损伤女性生殖功能的关注。
1 Pivonello C,Muscogiuri G,Nardone A,et al.Bisphenol A:an emerging threat to female fertility.Reprod Biol Endocrin,2020,18:22.
2 Lim H,Ma L,Ma WG,et al.Hoxa-10 regulates uterine stromal cell responsiveness to progesterone during implantation and decidualization in the mouse.Mol Endocrinol,1999,13:1005-17.
3 Fei X,Chung H,Taylor HS.Methoxychlor disrupts uterine Hoxa10 gene expression.endocrinology(Philadelphia),2005,146:3445-3451.
4 Xiong Y,Wen X,Liu H,et al.Bisphenol a affects endometrial stromal cells decidualization,involvement of epigenetic regulation.J Steroid Biochem,2020,200:105640.
5 Xiong Y,Wang Y,Ma L,et al.Mixed-lineage leukaemia 1 contributes to endometrial stromal cells progesterone responsiveness during decidualization.J Cell Mol Med,2021,25:297-308.
6 Rahmani S,Pour Khalili N,Khan F,et al.Bisphenol A:What lies beneath its induced diabetes and the epigenetic modulation? Life Sci,2018,214:136-144.
7 Calafat AM,Ye X,Wong L,et al.Exposure of the U.S.population to bisphenol A and 4-tertiary-octylphenol:2003-2004.Environ Health Persp,2008,116:39-44.
8 Eladak S,Grisin T,Moison D,et al.A new chapter in the bisphenol A story:bisphenol S and bisphenol F are not safe alternatives to this compound.Fertil Steril,2015,103:11-21.
9 Vandenberg LN,Hunt PA,Myers JP,et al.Human exposures to bisphenol A:mismatches between data and assumptions.Rev Environ Health,2013,28:37-58.
10 Olson MR,Su R,Flaws JA,et al.Bisphenol A impairs decidualization of human uterine stromal fibroblasts.Reprod Toxicol,2017,73:339-344.
11 Aghajanova L,Giudice LC.Effect of bisphenol A on human endometrial stromal fibroblasts in vitro.Reprod Biomed Online,2011,22:249-256.
12 Mannelli C,Szóstek AZ,Lukasik K,et al.Bisphenol A modulates receptivity and secretory function of human decidual cells:an in vitro study.Reproduction,2015,150:115-125.
13 Forte M,Mita L,Cobellis L,et al.Triclosan and bisphenol a affect decidualization of human endometrial stromal cells.Mol Cell Endocrinol,2016,422:74-83.
14 Abraham A,Chakraborty P.A review on sources and health impacts of bisphenol A.REV Environ Health,2020,35:201-210.
15 Kaustov L,Lemak A,Wu H,et al.The MLL1 trimeric catalytic complex is a dynamic conformational ensemble stabilized by multiple weak interactions.Nucleic Acids Res,2019,47:9433-9447.
16 Ashary N,Laheri S,Modi D.Homeobox genes in endometrium:from development to decidualization.Int J Dev Biol,2020,64:227-237.
17 Xu Y,Lu J,Wu J,et al.HOXA10 co-factor MEIS1 is required for the decidualization in human endometrial stromal cell.J Mel Endocrinol,2020,64:249-258.
18 Han K,Zhou Q.Skp2 deteriorates the uterine receptivity by interacting with HOXA10 and promoting its degradation.Reprod Sci,2021,28:1069-1078.
19 Tamura I,Ohkawa Y,Sato T,et al.Genome-wide analysis of histone modifications in human endometrial stromal cells.Mol Endocrinol,2014,28:1656-1669.
20 Mishra BP,Ansari KI,Mandal SS.Dynamic association of MLL1,H3K4 trimethylation with chromatin and Hox gene expression during the cell cycle.Febs J,2009,276:1629-1640.
21 Yao J,Fang L,Yang Z,et al.Mixed lineage leukaemia histone methylases 1 collaborate with ERα to regulate HOXA10 expression in AML.Bioscience Rep,2014,34:e00156.