测序深度对无创产前检测效能的影响分析

染色体非整倍体无创产前基因检测(non-invasive prenatal testing，NIPT)是一种利用二代高通量测序方法检测孕妇外周血中胎儿游离DNA(cell-free fetal DNA，cffDNA)片段的无创产前筛查技术，已成功用于检测常见的常染色体三体，包括21-三体、18-三体、13-三体[1]，与超声影像学筛查及血清学筛查等传统筛查方法相比，NIPT具有高灵敏度、特异性等优势[2-3]。但约15%的染色体异常不能被传统的NIPT检出，包括性染色体非整倍体(sex chromosome aneuploidies, SCAs)、罕见常染色体非整倍体(rare chromosome aneuploidies，RCAs)和微缺失微重复综合征(microdeletion/microduplication syndrome，MMS)等[4]。近年来，国内外知名的NIPT服务商陆续推出了针对MMS进行检测的升级版无创产前筛查技术NIPT-plus[5]，主要改进技术为增加测序深度、优化生物信息分析算法。据文献报道，NIPT-plus通过增加测序数据量一定程度上可以提高NIPT技术的灵敏度和特异度[6]。Yang等[7]对42 969例选择NIPT和7 770例选择NIPT-plus的孕妇在测序深度分别为0.15×和0.4×下进行检测，结果显示在0.4×的测序深度下，对于MMS有更高的检出率和阳性预测值(positive predictive value，PPV)。王文等[8]的研究结果表明，NIPT-plus可以提高性染色体异常的PPV。

目前，对于NIPT-plus的临床数据较少，已有的研究主要聚焦于因基因组拷贝数变异(copy number variations，CNVs)导致的染色体MMS[9-10]。但对于临床遗传咨询时，针对不同的情况是否均有必要选择NIPT-plus鲜有报道，以及NIPT通过增加测序深度能否降低假阳性率、提高检出率缺少有效的评估。本研究对2018年8月—2020年12月在内蒙古妇幼保健院行NIPT和NIPT-plus的孕妇资料进行回顾性分析，并以经产前诊断判定为NIPT假阳性和假阴性样本为研究对象，通过增加测序深度，对比分析NIPT与NIPT-plus的检测效能，为临床遗传咨询中选择哪种NIPT检测方法提供参考依据。

对象与方法

一、研究对象

选取2018年8月—2020年12月在内蒙古妇幼保健院就诊，经门诊医师充分告知常规产前诊断方法，自愿选择NIPT的孕妇36 730例，年龄17～49岁，孕周12～37周和自愿选择NIPT-plus的孕妇4 633例，年龄17～47岁，孕周12～34周，所有孕妇一年内无异体输血、移植、免疫治疗等异体细胞输入史，对其无创产前筛查结果及高风险孕妇产前诊断结果进行回顾性分析；选取经产前诊断确诊的77例NIPT假阳性和4例NIPT假阴性样本作为研究对象，所有孕妇均签署知情同意书，本研究经内蒙古自治区妇幼保健院伦理委员会批准(No.2019007-1)。

二、研究方法

1.主要试剂及仪器：核酸提取试剂盒和胎儿染色体非整倍体(T21、T18、T13)检测试剂盒、测序反应通用试剂盒(联合探针锚定聚合测序法)均购自武汉华大生物科技有限公司。BGISEQ 500型基因测序仪购自深圳华大生物医学有限责任公司。

2. NIPT检测方法：使用专用真空采血管采集孕妇外周血5 mL，常温下暂存，在96 h内分离血浆。外周血在4℃条件下1 600 ×g低速离心10 min，吸取上层血浆，然后以 16 000 ×g高速离心10 min，吸取血浆。利用核酸提取试剂盒从血浆中提取游离DNA，然后使用胎儿染色体非整倍体(T21、T18、T13)检测试剂盒经过末端修复、接头连接、PCR扩增进行DNA文库制备。质检合格后，进行文库pooling，对pooling后的DNA文库进行环化处理，然后通过滚环复制反应制备DNA纳米球。借助BGISEQ 500型基因测序仪应用联合探针锚定聚合测序法进行单端测序，reads长度为35 bp，将测序所得reads比对人类基因组(GRCh37/hg19)，综合运用Y染色体法和seqFF估算法，评估样本中胎儿游离DNA比例[11]。测序深度为0.1×，单个样本有效数据量不低于3.5 Mb，无扩增偏倚，cffDNA比例≥3.5%时，根据标准化Z值评估结果，若 -3<Z<3，结果为低风险。

3. NIPT-plus检测方法：与NIPT相比，NIPT-plus的主要改进技术为提高测序数据量和优化信息分析算法。血浆分离、核酸提取、文库制备、制备DNA纳米球均与NIPT方法相同，使用BGISEQ500型基因测序仪进行单端测序，reads长度为35 bp，运用RUPA算法将原始reads比对人类基因组(GRCh37/hg19)[12]，测序深度为0.3×，单个样本有效数据量不低于25 Mb，无扩增偏倚，cffDNA比例≥3.5%时，根据标准化Z值评估结果，若 -3<Z<3，结果为低风险。

4.技术路线：见图1。

5.统计学处理：使用SPSS 20.0版软件进行统计分析，采用Pearson卡方检验和fisher确切概率法进行统计分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

结果

一、 NIPT和NIPT-plus检测结果对比分析

1.常见非整倍体(T21、T18、T13)检测结果对比分析：行NIPT检测的36 730名孕妇中，筛查结果为T21、T18、T13的总数为153例，90例选择产前诊断，经随访及核型分析有3例判定为假阴性样本。行NIPT-plus的4 633名孕妇中，筛查结果为T21、T18、T13的总数为36例，26例选择产前诊断，未发现假阴性病例。两种检测方法筛查T21的PPV分别为(91.07% vs. 83.33%，P=0.782)、T18的PPV分别为(46.15% vs. 9.09%，P=0.057)、T13的PPV分别为(12.50% vs. 0%，P=1.00)，其两者均无显著性差异、复合三体(T21、T18、T13)的PPV分别为(71.11% vs. 42.31%，P=0.007)，两者具有显著性差异(见表1)。

两种检测方法筛查T21的灵敏度分别为96.23% vs. 100%，特异度为99.99% vs. 99.96 %、T18的灵敏度分别为 92.31% vs. 100% ，特异度为99.96% vs. 99.78%、T13的灵敏度分别为100% vs. 0%，特异度为99.98% vs. 99.94%(见表2)。

2.SCAs、RCAs和MMS检测结果对比分析：行NIPT检测的36 730名孕妇中，筛查结果为SCAs、RCAs、MMS的总数为217例，127例选择产前诊断，经电话随访及核型分析有1例判定为假阴性样本。行NIPT-plus的4 633名孕妇中，筛查结果为SCAs、RCAs、MMS的总数为46例，35例选择产前诊断，未发现假阴性病例。两种检测方法筛查SCAs的PPV分别为53.97% vs. 42.86%，P=0.452、RCAs的PPV分别为15.38% vs. 33.33%，P=0.310、MMS的PPV分别为36.84% vs. 20.00%，P=0.392，其两者均无显著性差异(见表3)。

两种检测方法筛查SCAs的灵敏度均为100%，特异度为99.92% vs. 99.83% 、RCAs的灵敏度分别为 80.00% vs. 100% ，特异度为99.94% vs. 99.91%、MMS的灵敏度均为100%，特异度为99.93% vs. 99.74%(见表4)。

二、NIPT假阳性、假阴性样本与NIPT-plus检测对比分析

77例NIPT假阳性样本(21例常见三体(T21、T18、T13)、26例SCAs、17例RCAs、13例MMS)原备份血浆行NIPT-plus复检后，6例(7.79%)检测结果由高风险转变为低风险，与产前诊断结果一致，见表5。

6例中常见三体(T21、T18、T13)、SCAs、RCAs和MMS假阳性样本的检测结果由高风险转变为低风险的占比分别为4.76%(1/21)、0%(0/26)、17.64%(3/17)和15.38%(2/13)。4例假阴性样本行NIPT-plus后，其中3例结果仍为低风险，依旧判定为假阴性；1例经NIPT-plus检测后结果为T15，与产前诊断结果一致，见表6。

讨论

本研究对NIPT和NIPT-plus筛查胎儿染色体非整倍体的检测效能进行了比较分析，包括常见染色体非整倍体(T21、T18、T13)、SCAs、RCAs和MMS。不同实验室，NIPT检测染色体非整倍体的PPV差异较大，根据国内外报道的数据统计趋势，T21、T18和T13的PPV范围分别为71.4%～92.2%、50.0%～82.6%、12.5%～46.7%[13]，本研究结果与文献报道的基本一致，NIPT的T21、T18和T13的PPV分别为91.07%、46.15%和12.50%，NIPT-plus的PPV分别为83.33%、9.09%和0。其中筛查复合三体(T21、T18、T13)的PPV NIPT显著高于NIPT-plus(71.11% vs 42.31%，P<0.05)。有研究对94 085名单胎妊娠女性行NIPT-plus，其T21、T18和T13的PPV分别为95%、82%和46%[14]，与本研究的结果不一致，推测由于本研究NIPT-plus的样本量较少(接受产前诊断的T21高风险12例，确诊10例；T18高风险15例，确诊1例；T13高风险4例，确诊0例)是NIPT筛查常见染色体非整倍体的PPV显著高于NIPT-plus的原因。

NIPT筛查SCAs、RCAs和MMS的PPV均与NIPT-plus没有显著性差异，两者的灵敏度和特异度均基本保持一致。本研究对上述染色体异常类型的筛查，测序深度增加3倍，NIPT-plus与NIPT相比并未表现出明显的优势。本研究中NIPT-plus的SCAs、RCAs和MMS的PPV分别为42.86%、33.33%和20.00%，另一项对24 702例行NIPT-plus检测的回顾性分析表明，其SCAs、RCAs和MMS的PPV分别为59.32%、6.45% 和 50%[15]，两者对比发现，本研究的SCAs和MMS的PPV显著较低，而RCAs的PPV显著较高，推测与不同实验室纳入的人群、样本量和生物信息学算法，以及不同检测平台对研究明确的MMS检出范围不同有关，因此有待更多的临床数据做进一步的分析。

本研究以77例NIPT假阳性样本和4例NIPT假阴性样本作为研究对象，对其备份血浆行NIPT-plus。结果表明，77例假阳性样本中有6例(7.79%)经检测后转变为低风险，与产前诊断结果一致，其中常见三体(T21、T18、T13)、SCAs、RCAs和MMS假阳性样本的结果由高风险转变为低风险的占比分别为4.76%(1/21)、0%(0/26)、17.64%(3/17)和15.38%(2/13)，RCAs假阳性样本由高风险转变为低风险的比例最高。4例假阴性样本行NIPT-plus后，3例仍为低风险，与产前诊断结果不一致，依旧判定为假阴性样本，1例转变为T15高风险，与产前诊断结果一致，提示NIPT-plus在一定程度上可降低RCAs假阳性率。最新一项研究对50例NIPT-plus检测结果阳性的样本行NIPT复检，其结果显示，NIPT漏检了1例T18和1例罕见常染色体非整倍体[16]，与本研究的结果相似。NIPT检出的RCAs可提示胎盘也可能存在异常，建议在遗传咨询中关注胎儿生长发育情况。

综上所述，本研究结果表明，NIPT和NIPT-plus在整体的检测效能上并没有显著性的差异，但通过增加测序深度一定程度上可以降低NIPT的假阳性率和RCAs的漏检率。因此，NIPT-plus具有一定的临床应用价值，在遗传咨询时可根据孕妇的风险值做合理选择。

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