·综述·
胚胎植入前遗传学检测(preimplantation genetic testing，PGT)技术是在胚胎移植前，取出早期胚胎细胞进行遗传学检测和分析，将染色体正常的胚胎移植入母体宫腔内，能有效提高体外受精-胚胎移植( in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET )的临床妊娠率和胚胎植入率，降低流产率[1]。其中，胚胎染色体非整倍体筛查(preimplantation genetic testing for aneuploidy，PGT-A)技术的临床意义在于检测胚胎染色体是否存在非整倍体现象，从而筛选出整倍体胚胎进行移植，这已在人类辅助生殖技术(assisted reproductive technology，ART)中广泛应用。但PGT技术需对胚胎进行活检操作，可能影响胚胎发育，其安全性有待进一步研究[2]。近年来，随着对胚胎游离DNA(cell-free DNA)的研究，使无创胚胎植入前遗传学检测(noninvasive preimplantation genetic testing，Ni-PGT)技术成为可能。2016年，无创胚胎染色体筛查(non-invasive chromosome screening，NICS)技术的应用已有活产报道，此项技术通过提取胚胎培养液中的游离DNA，采用多次退火环状循环扩增(multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC)技术结合二代测序(next generation sequencing，NGS)，以无创的方式对胚胎进行染色体筛查，并比较了胚胎培养液中游离DNA与对应的整个胚胎的24条染色体整倍体情况，结果显示NICS的敏感度和特异性达88.2%和84.0%[3]。此外，NICS技术的无创、安全、简单有效等优点，在筛选整倍体胚胎方面具有较高的临床应用价值，已成为ART中的研究热点。但Ni-PGT技术仍存在样本获取困难、样本污染、检测准确性有待提高等问题，有待进一步深入探索。
胚胎游离DNA是胚胎在体外发育过程中将胚胎游离DNA分子及片段释放到囊胚腔液及胚胎培养液中的一种生物学标志物[4]。Stigliani等[5]在2013年发现，胚胎在发育早期即可释放胚胎游离DNA到胚胎培养液中，包括基因组DNA与线粒体DNA，并且证明高线粒体DNA/基因组DNA比率与胚胎质量差和高度碎片化相关。另有研究显示胚胎培养的第3天胚胎培养液中高线粒体DNA/基因组DNA比率与优质胚胎的形成有关，这为应用胚胎游离DNA进行胚胎植入前筛选奠定了基础[6]。除了胚胎培养液，胚胎游离DNA还来源于囊胚腔液，在Palini等[7]的报道中提出，在收集到的囊胚腔液样本中约90.0%存在基因组DNA，并采用实时PCR技术成功扩增到17 号染色体上的多拷贝基因(TBC1D3)和Y 染色体上的多拷贝基因(TSPY1)。另有研究发现胚胎游离DNA也可以对单基因遗传病进行检测，这在α、β地中海贫血中已有报道[8-9]。黄锦等[10]利用NICS方法对囊胚整倍性进行检测时发现，当NICS的结果提示一些重要染色体(13、15、16、18、21、22号染色体)为整倍体时，对应囊胚的该条染色体整倍性几率高，但当NICS结果提示这些染色体为非整倍体时，对应胚胎并不一定为非整倍体，可见，在利用胚胎培养液中游离DNA检测技术还具有一定的挑战。
从胚胎培养液或囊胚腔液中获得的胚胎游离DNA可用于Ni-PGT，但胚胎游离DNA是如何产生的呢？Huang等[11]证明胚胎游离DNA可能来自胚胎发育过程中滋养外胚层(trophectoderm，TE)和内细胞团(inner cell mass，ICM)的细胞凋亡，且ICM细胞发生凋亡的比例大于TE细胞，凋亡的整倍体细胞数量远远超过非整倍体细胞，这也为Ni-PGT的应用提供了理论基础。然而，Gleicher等[12]认为胚胎游离DNA主要来自TE细胞，且胚胎在发育过程中存在自我校正，非整倍体胚胎在后期可发育成整倍体，即无法明确胚胎的最终核型，从而导致假阳性率偏高。对此，Huang等[13]给出了相应的解释，人类的非整倍体胚胎主要来自胚胎早期错误的有丝分裂，很少来自减数分裂，且有丝分裂校正率通常低至0～17.2%，最多为40.0%；另一方面，Huang等在观察嵌合体小鼠胚胎过程中发现，ICM中非整倍体细胞凋亡的频率是TE非整倍体细胞的10倍，由此证明PGT-A的假阳性率高的最可能解释是嵌合体，而非胚胎的自我纠正。Hammond等[14]发现，早期胚胎存在自我修复机制，在囊胚发育过程中，遗传物质可能通过细胞裂解，凋亡或碎片脱落从TE细胞和ICM细胞中释放到囊胚腔液和胚胎培养液中。从目前研究来看，胚胎游离DNA主要来自胚胎细胞的正常凋亡，但尚无明确机制说明，还需进一步研究。
胚胎游离DNA的获取主要包括胚胎培养液或囊胚腔液。假设通过胚胎培养液及囊胚腔液相结合，可增加胚胎游离DNA含量，进而提高游离DNA扩增率，但有研究表明通过释放囊胚腔液到培养液中并没有增加胚胎游离DNA的含量，反而因侵入性操作，可能会影响胚胎发育[15]。Chen等[16]通过对胚胎游离DNA进行全基因组测序，发现其中可检测到来自第二极体、精子、颗粒细胞DNA分子，同时，这些DNA分子可能成为样本污染源，干扰检测结果，只有胚胎源性的游离DNA分子才能更好的反应胚胎情况。
1.胚胎游离DNA样本污染影响检测准确性：Xu等[17]报道胚胎游离DNA的污染来源有母源性的颗粒细胞、精子、极体、周围环境污染等，其中，颗粒细胞可能是胚胎游离DNA的主要污染源，在胚胎培养过程中通过多次冲洗颗粒细胞来减少母源性污染。有学者通过使用存在于Y染色体(TSPY1)和17号染色体(TBC1D3)的多拷贝基因验证胚胎培养液中存在可检测到的Y染色体并非所有都是代表雄性胚胎，有可能是来自培养液的污染[7]。对于精子来源的污染，可以通过卵胞浆内单精子显微注射技术(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)在最大程度上减少污染，ICSI可能更适合用于胚胎染色体筛查，目前，关于不同受精方式对检测结果的影响研究数据尚少[18-19]。有研究报道培养液中添加的血清白蛋白，血清替代物有可能会影响胚胎发育[20]。
2.胚胎游离DNA样本收集时间对检测准确性的影响：有关胚胎游离DNA样本的最佳收集时间尚未确定，Rubio等[21]报道胚胎游离DNA的量随着培养时间的延长而增加，且在第6天胚胎的信息性与一致性较高，胚胎在特定培养条件下的时间越长，特异性越高，对敏感性却没有显著影响[22]。但有研究者认为随着胚胎培养时间的延长可能不利于胚胎发育，因存在DNA降解可能，进而影响检测结果[23]。未来有望进行大样本量试验对此进行验证，明确最佳样本收集时间。
3.胚胎培养液滴体积对检测准确性的影响：研究认为胚胎在体外培养的第4天进行培养液更换处理，使用更小的10 uL培养液滴，而不是较常使用的30 uL，更小的液滴可以得到更大的样品浓度，在一定程度上可以提高检测准确性[21]。此外，培养液滴的大小亦会影响囊胚形成率，胚胎在体外培养时，为了促进自身发育而形成一个自分泌循环体，较大体积的培养液滴可能稀释对胚胎发育有益的自分泌因子；然而在小的培养液滴中，胚胎更有可能暴露于胚胎产生的毒性代谢产物，并可能导致发育迟缓或停滞[24]。Minasi等[25]报道随着培养液滴体积的减小，可以平衡自分泌因子的有益作用以及胚胎毒性物质和蒸发的负面影响，改善了胚胎体外发育，囊胚形成率也会提高，但最佳培养液滴体积至今未有明确提出，值得进一步探索。
4.胚胎培养液收集方式对检测准确性的影响：有研究通过对胚胎培养液收集方法进行优化并提出，在卵裂期增加一次颗粒细胞的去除，且对胚胎不进行打孔操作，收集D4到D5或D6的胚胎培养液，检测结果提示胚胎游离DNA与PGT检测的胚胎整倍性符合率最高，且污染率最低[26]。由此可见，这不仅可以减少样本污染，而且操作较简单。
5.胚胎嵌合体对检测准确性的影响：嵌合体在人类胚胎发育过程中很常见，可导致遗传异常，流产，死产或活产，嵌合体是具有发育整倍体胚胎的可能性。嵌合体的嵌合阈值设置不适当，可能会导致假阳性、假阴性结果。在一项研究中，设置嵌合阈值为60.0%的情况下，Ni-PGT检测结果得到了最低的假阳性率与假阴性率[11]。由于试验条件及研究标准的不同，有待探讨嵌合阈值的最佳范围。
综上所述，影响胚胎游离DNA检测准确性的因素众多，其中的关键因素在于胚胎游离DNA样本量及样本污染问题，为此，减少样本污染、选用合适的胚胎游离DNA检测技术，对提高检测准确性有重要意义。
胚胎游离DNA样本量制约着检测技术的选择，给扩增及测序技术带来极大挑战，全基因扩增技术(whole genome amplification,WGA)可有效扩增低分子量DNA，可对单个细胞的整个基因组DNA进行扩增，可明显提高检测准确性[27]，目前的WGA主要包括引物延伸预扩增法(primer extension preamplification，PEP)、简并寡核苷酸引物PCR(degenerate oligonucleotide primed PCR，DOP-PCR)、连接介导PCR(ligation-mediated PCR，LM-PCR)、基于恒温核酸扩增技术的多重置换扩增法(multiple displacement amplification，MDA)、基于引物酶的全基因组扩增(primer-based whole genome amplification，p-WGA)、MALBAC，Sure-Plex试剂盒等，目前，后三种技术应用较多，且有各自的优点。其中，MALBAC结合了MDA 法与 PCR方法的特点，应用较广，但假阳性率偏高[28]，目前尚未明确哪一种WGA 技术最适合NICS。NGS和微阵列比较基因组杂交(array-based comparative genomic hybridization，a-CGH)是目前进行胚胎植入前遗传学筛查的主要的两种DNA检测方法，与a-CGH相比，NGS对于低水平嵌合和三倍体的检出会更为敏感，且NGS具有快速、成本低等优点[29]。
胚胎游离DNA主要来自胚胎发育过程中的胚胎细胞凋亡。通过检测胚胎游离DNA进行无创PGT技术具有无创、简单、便宜等优点，在体外辅助生殖技术领域中应用前景巨大，但胚胎游离DNA检测技术由于样本量少、样本获取困难、样本污染等问题影响检测准确性和特异性，并制约其临床应用。随着科学技术的发展，将在改进胚胎游离DNA收集方法、DNA扩增和筛选技术等方面进行深入研究，以提高胚胎游离DNA检测准确性和特异性，使胚胎游离DNA可用于常规IVF患者的胚胎移植，将遗传筛查窗口提前，可为提高IVF-ET 患者的胚胎种植率和临床妊娠率提供新思路。
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