早产是导致新生儿死亡的主要原因之一,对儿童视听能力、认知行为等产生影响,与儿童神经发育结局相关[1]。全球每年早产儿人数约为1 500万,在全球新生儿死亡中约有35%是由于早产并发症引起[2]。虽然此前已经发现多种早产的病理生理学机制和因素,包括炎症、感染、免疫、遗传、胎盘形成异常、氧化应激增加等,但是早产的病因目前尚不明确,且临床救治效果有限[3]。因此,早产的有效预测对于改善新生儿预后,降低病死风险具有重要价值。中国将早产定义为妊娠满28周至不足37周的分娩。由于不同国家的救治水平存在差异,早产下限的设置不同,欧洲的早产下限为妊娠满22周[4]。全球早产发生率长期处于较高状态,估计显示,2014年全球早产发生率为10.6%,中国早产发生数位居全球第二,约占全球早产发生数的12.0%[5]。早产的高危因素中的母体因素包括年龄、体重过轻或肥胖、不良生活习惯、心理压力、泌尿道感染、生殖道感染以及阴道流血等[6]。随着中国生育政策的调整,出现较多的高龄产妇,而高龄作为早产的高危因素之一可能造成国内早产儿数量的进一步增加。因此,加强对早产预测方法及临床实践应用的进一步研究显得更加重要。既往研究发现,血液无创检测的生物标志物可应用于识别早产风险[31]。本文就与早产预测相关的母体血液生物标志物及无创血液检测方法的应用前景进行阐述。
一、早产预测的传统方法
1.超声检查预测早产:通过超声检查来预测早产风险目前已成为临床上公认的有效方法,宫颈超声评估包括经会阴、经阴道、经腹这三种方式,通过测量宫颈长度或观察宫颈形态,达到预测早产的目的,其中经阴道超声测量宫颈长度的方法应用度相对更高[7]。中国《早产临床诊断与治疗指南2014年版》指出,经阴道测量宫颈长度小于25 mm属于早产高风险[8]。目前这一标准已成为固定使用的界定值,但由于宫颈短是多个因素作用的结果,且孕产妇的身高、体重、胎次都被证实与宫颈长度相关,因此仅根据宫颈长度小于25 mm可能不是最佳的预测方式[9]。有研究显示[10],与经产妇相比,妊娠37周前宫颈长度预测早产风险的价值在初产妇中更高,妊娠34周前的预测结果也存在这种差异性。此外,关于宫颈长度的测量时间与测量次数尚未有确定的标准。综上所述,通过测量宫颈长度预测早产的方式有待进一步优化。
2.胎儿纤维连接蛋白预测早产:胎儿纤维连接蛋白(fetalfibronectin,fFN)是一种集中于滋养层和蜕膜之间区域的糖蛋白,临床上可以通过测定宫颈阴道分泌物中fFN的含量来预测早产风险。在没有超声评估的情况下,测量宫颈阴道分泌液中fFN的浓度已成为较为成熟的生化试验,具有广泛实施的可能性[11]。2018年,Melchor等[12]比较了胎盘微球蛋白-1(PAMG-1)和fFN两种指标在评估自发早产风险中的作用,研究结果显示,fFN在7日内自发早产预测的测试中敏感性和特异性分别达到30.0%和90.5%,在14日内自发早产预测的测试中为25.0%和90.4%,但其阳性预测价值较低,即阳性检测结果的可靠性有限。因此,目前来看,将fFN作为单独指标预测早产在临床应用中仍然具有一定的局限性[13]。
二、早产预测的新型血液生物标志物
1.蛋白质:近年来,有部分研究者选择通过蛋白组学分析鉴定可用于早产预测的血清蛋白,其中有部分预测因子已得到验证。母体血清C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)作为与炎症反应相关的非特异性标志物,与感染密切相关,已被证实在临床上有助于判断胎膜早破,而早产与感染之间也存在紧密联系,且既往有研究显示早产孕妇的血清CRP水平在孕中期时明显高于足月孕妇,当CRP水平超过一定范围会显著增加早产发生风险[14],因此,可以将CRP作为早产的相关标志物。除了CRP之外,有研究提出胰岛素样生长因子结合蛋白-3(insulin-like growth factor binding protein 3,IGFBP-3)也可作为早产的独立预测因子,在研究结果中,说明IGFBP-3预测早产准确性的ROC曲线下面积为0.79[15]。胰岛素样生长因子(insulin-like growth factors,IGFs)可以在胎盘功能、妊娠早期胎儿发育等方面发挥作用,并在循环中与IGFBP-3相结合,延长IGFs的半衰期。胰岛素样生长因子结合蛋白(insulin-like growth factor binding proteins,IBPs)家族的另一成员胰岛素样生长因子结合蛋白4(insulin-like growth factore binding protein 4,IBP4)在早产中也具有重要意义,Saade等[16]在发现和验证过程中确定了IBP4和性激素结合球蛋白(sex hormone binding globulin,SHBG)两种血清蛋白可作为自发性早产的预测因子,利用IBP4/SHBG建立分类器,该分类器对于预测早产的敏感性和特异性分别为75%、74%,显示出对早期发现早产风险孕妇的重要价值。除此之外,有研究证明血清钙调节蛋白-1和血清铁蛋白与早产的发生也具有相关性,但血清钙调节蛋白-1水平仅为轻度升高,不具备足够的临床意义,需要扩大样本量进行进一步研究[17]。而血清铁蛋白水平的升高可能是对于机体的潜在感染的应激反应,但研究结果[18]显示,该指标的ROC曲线下面积为0.796,特异性可达到89.2%,仍具备一定预测价值,因此,临床上可对于出现该指标水平升高的孕妇仍然要予以重视。
除血清蛋白外,也有部分研究学者选择对母体血液的血浆样本进行分析,寻找对于早产预测有意义的蛋白类生物标志物。在过去的一项研究中,研究者对所选样本的血浆蛋白水平进行分析,观察了几种候选蛋白的表达变化,包括内皮抑素、脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharide binding protein,LBP)、巨噬细胞炎症蛋白-1α(MIP-1α)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2),研究结果显示,血浆LBP、内皮抑素和MIP-1α有望成为预测自发性早产的潜在新型生物标志物[19]。与早产相关的血浆生物标志物往往与炎症相关,既往有研究证明,晚期糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation end products,RAGE)介导的炎症反应对早产发生具有一定影响,妊娠中期RAGE的可溶性形式即可溶性RAGE(soluble RAGE,sRAGE)水平在羊水中的显著增加可能与炎症反应以及免疫调节有关[20]。基于这一相关性,Rzepka等[21]选择对母体血浆样本进行分析,发现sRAGE预测早产的敏感性及特异性分别为51.3%和93.5%,对于早产的预先诊断确实存在重要意义。
2.DNA:因分子生物学技术与无创产前检测技术的成熟与发展,从母体血浆及血清中提取可用于检测的DNA应用于不良妊娠结局的早期筛查具有可行性。作为研究热点之一的细胞游离DNA(circulating free DNA,cfDNA)可以在血清和血浆中循环,母体外周血中胎儿游离DNA(Cell-free fetal DNA,cffDNA)伴随着胎龄的增加以及妊娠并发症的出现而增加其水平[22]。早在1998年,已有研究人员发现早产孕妇的cffDNA水平明显高于未出现早产的孕妇[23]。随后关于cffDNA与妊娠结局相关的研究中也有发现类似的结果,但在2016年一项评估cffDNA与不良妊娠结局的研究中,研究结果显示cffDNA与自发性早产并不具有显著相关性[24]。由于提取和量化cffDNA的方式都具有较大的异质性,所以目前仍难以对cffDNA与早产之间存在的矛盾性结果做出准确的判定。但随着对于表观遗传因素与妊娠结局之间的了解逐渐加深,研究发现DNA甲基化也是早产的一个贡献因素[25]。Hong等[26]在一项对美国具有早产高危风险的黑人女性进行的表观基因组研究中,同时收集了脐血及母体血液样本,系统性观察母体DNA甲基化与早产的关联性,其研究鉴定出两个分别位于CYTIP和LINC00114基因启动子区域的差异甲基化位点,与足月分娩的母亲相比,早期发生自发性早产的母亲全血中均发生了低甲基化。尽管这种关联在脐血样本中未被观察到,但仍然为妊娠早期对于早产风险的预测提供了一组可能作为生物标志物的位点。
3.RNA:miRNA与多种疾病的发生发展密切相关,因此,miRNA作为新生物标志物的潜力成为众多学者感兴趣的领域。在此背景下,来自斯坦福大学的研究人员[27]对于是否可以通过监测母体血液中胎儿的细胞游离RNA(cell-free RNA,cfRNA)转录来评估早产风险进行了探讨,研究在25名足月孕妇和13名早产孕妇中进行,确定了7个可以准确分类早产2个月的孕妇的cfRNA转录本(CLCN3,DAPP1,PPBP,MAP3K7CL,MOB1B,RAB27B和 RGS18),并且由这些转录本构建的预测模型准确性可达75%。尽管该研究仍然存在样本量较少等局限性,但为血液样本中cfRNA识别早产风险提供了依据,在未来可通过进一步研究转化为临床实践。Gray等[28]将miRNA阵列用于分析妊娠20周首次怀孕的健康妇女的血浆样本,以鉴定可识别自发性早产风险的血浆miRNA。该研究结果显示,妊娠19～21周妇女的血浆中有7个miRNA(miR-548a,miR-548ai,miR-548aa,miR-548ak,miR-548n,miR-1253和miR-302b)在早产组与足月组之间有差异表达,与此同时,证明了母体血浆miR-223表达水平的升高与早产存在关联性,可能成为用于预测自发性早产风险的候选miRNA生物标志物。因此,血浆miRNA的差异表达可能为妊娠早期识别早产风险提供新的生物标志物,这也为研究者们提供了研究思路,可通过更大规模的研究来确定这些miRNA的预测价值[28]。有研究[29]称,EBF1(early B cell factor 1)的遗传变异与妊娠时间以及自发性早产有关,通过进一步的分析验证,研究人员发现EBF1的mRNA水平在早产和足月的母体血液样本中具有差异性,妊娠中晚期EBF1水平的下降与自发性早产风险的增加具有一定的相关性;因此,母亲血液中EBF1的低mRNA水平可能有助于在妊娠中期检测自发性早产的风险。
环状RNA(circular RNA,circRNA)作为在各种病理过程中发挥重要作用的新兴分子,其与早产的病理机制的联系还尚未明确。有研究人员针对此问题进行了探索,其研究[30]通过分析早产儿和足月孕妇外周血的RNA-seq数据,发现hsa-ANKFY1_0025、hsa-FAM13B_0019和hsa-NUSAP1_0010对早产具有较好的预测能力,这一新发现也为早产风险的评估提供了新思路。Weiner等[31]第一次在没有事先假设的情况下对自发性早产(≤32周)的妊娠中期孕妇的血浆转录组进行了发现及验证研究,验证结果确定了4种血浆细胞游离RNA(APOA4、LET-7g、NAMPT、PSME2),均在早产孕妇的血浆及胎盘中呈现过表达,且与妊娠小于32周早产的发生具有显著相关性,这一发现也表明了血浆转录组对于协助早产的病理诊断的极大潜力。
4.代谢物:Sylveste等[32]开发了一项血液测试研究,发现可以通过测量血清代谢物来确定胎龄并评估早产风险。该项研究利用甘油磷脂、鞘脂、牛磺酸和花生四烯酸等10种代谢途径组成的算法,开发了早产的预测模型,模型的预测准确性保持较高水平,目前研究结果显示,甘油磷脂途径代谢在早产风险方面具有积极的主导的作用,鞘脂代谢、花生四烯酸代谢以及精氨酸和脯氨酸代谢也被发现与早产有关。在另一项研究中,母体血液代谢物对于预测胎龄的作用也得到了验证,研究人员分析了来自30名孕妇的784份血液样本的非靶向代谢组,利用四氢脱氧皮质酮(tetrahydrodeoxycorticosterone,THDOC)、雌三醇-16-葡萄糖醛酸(Estriol-16-Glucuronide)、黄体酮、脱氧异雄酮硫酸盐(dehydroepiandrosterone sulfate,DHEA-S)、磷脂酰乙醇胺PE(p-16:0e/0:0)五种代谢物组成代谢时钟,建立胎龄预测模型,且模型的预测结果与超声结果高度一致,显示出了较好的预测性能[33]。虽然这些研究结果显示,可以使用少量的母体血液代谢物来对正常受试者的妊娠阶段进行精确分类,但仍需要在更大的独立队列中进一步验证。因此,开发包含母体血液代谢物的临床检测工具对于进一步识别早产风险是十分有价值的,这也值得研究人员进行更加深入的探索。
三、无创血液检测的应用前景
尽管目前对于疾病的预测与诊断已有较为成熟的放射学方法和超声技术,但以检测血液、尿液等体液中生物标志物为基础的液体活检方法因其无创、简便和灵敏性而备受关注。无创血液检测所鉴定的生物标志物已展现出对于早期评估早产风险的潜力,见表1。血液样本中cfDNA、cfRNA等生物标志物结合机器学习算法构成的智能预测模型,在预测早产和子痫前期等妊娠并发症中的价值与意义正在被不断证实,利用血液样本的转录组特征可以独立于临床因素来跟踪妊娠进展[34]。
表1 早产预测的新型血液生物标志物
生物种类来源生物标志物 蛋白质 血清CRP,SHBG,IBP4,IGFBP-3,血清铁蛋白 血浆LBP,内皮抑素,MIP-1α,sRAGERNA 血浆CLCN3,DAPP1,PPBP,MAP3K7CL,MOB1B,RAB27B,RGS18,miR-223,miR-548a,miR-548ai,miR-548aa,miR-548ak,miR-548n,miR-1253,miR-302b,APOA4,LET-7g,NAMPT,PSME2 全血hsa-ANKFY1_0025,hsa-FAM13B_0019,hsa-NUSAP1_0010,EBF1DNA 全血CYTIP,LINC00114代谢物 血清甘油磷脂,鞘脂,花生四烯酸,精氨酸,脯氨酸 血浆THDOC,黄体酮,Estriol-16-Glucuronide,DHEA-S,PE(p-16:0e/0:0)
目前,超声检查和依据fFN的传统方法仍是临床实践中预测早产最为常用的手段,既往也有研究提出,可通过鉴定羊水中的生物标志物评估早产发生的风险,比如载脂蛋白A-IV(Apoa4)、Lumican(Lum)和Kininogen-1(Kng1)[35]。但获取羊水的过程中,有创性操作可能会引起感染和创伤风险,具有显著的局限性[20]。无创性血液检测的方法在临床实践中操作简便,具有更高的安全性以及推广度,价格低,风险小,孕妇接受程度高,即使在部分发展中国家或医疗条件水平较低的地区,这种血液检测的联合指标对于早产进行预测的方式也能够得以实现。
四、小结和展望
早产作为影响孕妇及围生期胎儿健康的重要因素,是值得全世界长期关注的热点问题。尽管目前已经有许多研究提出关于早产预测的候选生物标志物,但在应用于临床实践前仍需要进一步的验证分析,如何用更加简便高效的筛查指标估计早产风险仍然是一个严峻的挑战。通过血液指标检测鉴定与早产相关的生物标志物的方式,具有显著优势及广阔的发展前景,未来可通过更加全面的研究分析,为实现其临床应用提供依据,这一方式的实现对于改善早产孕妇的妊娠结局以及胎儿的预后具有重要意义。
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