子宫腺肌病疼痛发生发展的原因尚未明确,而其痛经的表现和严重程度存在较大个体差异,且保守治疗有一定局限性,因此其治疗仍有难度,需要进一步研究疼痛发生发展的机制。
辣椒素受体(transient receptor potential vanilloid 1,TRPV1)是分布于外周伤害性感受器上的受体,构成机体进行温度、化学或机械感受的物质基础[1],感受各种内源性和外源性的物理、化学等刺激[2],参与疼痛发生发展等多种生理功能[3]。TRPV1亦可能在子宫腺肌病疼痛的发生发展中起重要作用。P物质作为在初级感觉神经元中表达的“疼痛”神经递质,与TRPV1可能存在相互作用,这在子宫腺肌病疼痛中的价值值得进一步探索。而既往研究提示,雌激素对子宫腺肌病的发病和疼痛的机制起重要作用,雌激素或许对TRPV1起到一定的促进作用。
目前已有研究探索TRPV1在子宫内膜异位症疼痛中的表达和作用,但关于TRPV1在子宫腺肌病疼痛的发生发展中的相关作用的研究只有一项,且尚未有研究比较TRPV1、P物质和雌激素受体(estrogen receptor,ER)α在子宫腺肌病中的表达情况,以及分析其和疼痛的相关性及三者之间的相互作用。因此TRPV1、P物质和雌激素受体α在子宫腺肌病中的作用值得进一步探索。
本实验从mRNA和蛋白水平上对子宫腺肌病和正常对照子宫的ER-α、P物质和TRPV1受体的表达进行检测,以验证三者在两组中的表达差异,并分析三者与疼痛程度之间的关联性。
对象与方法
1.研究对象：选择2017年7月—2019年2月在北京大学第三医院进行了全子宫切除术或子宫腺肌病病灶切除术的51例患者为子宫腺肌病组,选取14例无子宫腺肌病或痛经,因宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)而接受全子宫切除术的绝经前患者作为正常对照组。
对于子宫腺肌病组和正常对照组,分别采集子宫外肌层子宫腺肌病病灶和正常肌层组织0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm。人体组织标本离体后15 min内完成采集,经液氮冷冻处理后放入-80 ℃冰箱中保存。
2.实验内容及方法
(1)RT-PCR。提取组织总mRNA,实验步骤按照RNA提取试剂TRIzol(北京普利莱基因技术有限公司)说明书进行。逆转录合成cDNA,将得到的cDNA取1 μL,依次加入ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(南京诺唯赞生物科技有限公司)10 μL,上、下游引物各1 μL,灭菌蒸馏水7 μL,总体积20 μL进行PCR反应。使用的StepOne实时荧光定量PCR仪购自美国Thermo Fisher Scientific公司。扩增条件为95 ℃预变性2 min,95 ℃变性10 s,58 ℃延伸30 s,共40个循环。目的基因TRPV1引物、P物质引物、ER-α引物和内参基因actin引物由上海擎科生物科技有限公司合成,引物序列和产物长度见表1。
表1 引物序列和产物长度
基因引物序列(5′-3′)产物长度(bp)Actin上游Actin下游TRPV1上游TRPV1下游ER-α上游ER-α下游SP上游SP下游GCACCGTCAAGGCTGAGAACTGGTGAAGACGCCAGTGGAGACCCCTAATCGCCACGACCAGGATCTCTCCAGTAACTCGGAAGGCAGCTTCAGTTCTAGAGATTGGTTAAACATATCTGCAAGGTTTGGTTATTTCTCAACAAAGCACACATGAAAACAAATAGGAAAAGCAC138223250163
(2) Western blot。将电泳分离后的组织总蛋白质从凝胶转移到聚偏二氟乙烯膜上,依次加入1：1 000多克隆兔抗人TRPV1抗体(美国Abcam)/单克隆兔抗人ER-α抗体(美国Abcam)和1：1 000辣根多氧化物酶结合的鼠抗人IgG(美国Abcam)。按照ECL发光液说明书避光显色,Chemi Doc XRS成像仪(Bio-Rad)拍照并用软件Quantity One 扫描光密度值进行半定量分析。
3.统计分析方法：本研究使用Microsoft Excel进行数据录入和管理。使用SPSS 20.0进行数据统计分析。对数据进行正态分布检验,如符合正态分布,则使用(均值±标准差)对数据进行描述,使用t检验进行统计学分析,利用Pearson相关系数对两个变量之间的关联性进行分析;如不符合正态分布,则使用[中位数(最小值,最大值)]对数据进行描述,使用非参数检验(Mann-Whitney U)进行统计学分析,并利用Spearman相关系数对两个变量之间的关联性进行分析。当双侧P<0.05,为差异有统计学意义。
结果
1.患者一般情况：两组患者的一般情况见表2。
表2 患者一般情况 [中位数(最小值,最大值)]
临床特征子宫腺肌病组(n=51)对照组(n=14)年龄(岁)46(30,55)45(40,49)月经增多 [n(%)]∗34(66.6)0(0)痛经情况 [n(%)] ∗ 无9(17.6)14(100) 轻度5(9.8)- 中度13(25.5)- 重度24(47.1)-糖类抗原125(CA125,U/mL)∗#101.37(9.0,844.4)14.04(8.1,29.6)合并卵巢子宫内膜异位症∗12(23.5)0(0)合并深部浸润型子宫内膜异位症(DIE)∗10(19.6)0(0)
注：两组比较,*P<0.05;#子宫腺肌病患者中有44例检测了CA125水平,对照组7例
2.正常对照组和子宫腺肌病组中TRPV1的差异表达：子宫腺肌病中TRPV1 mRNA表达高于正常对照组(P<0.01)(见图1)。TRPV1蛋白亦高于正常对照组(P<0.01)(见图2)。
图1 TRPV1、P物质和ER-αmRNA在正常对照组和子宫腺肌病组中的表达
(a)TRPV1 mRNA表达在子宫腺肌病组中高于正常对照组;(b)P物质mRNA表达在子宫腺肌病组中高于正常对照组;(c)ER-α mRNA表达在子宫腺肌病组中高于正常对照组;*P<0.01
图2 TRPV1和ER-α蛋白在正常对照组和子宫腺肌病组中的表达
(a)TRPV1蛋白表达在子宫腺肌病中高于正常对照组;(b)ER-α表达在子宫腺肌病组与正常对照组间无明显差异;(*P<0.01,nsP >0.05);
3.正常对照组和子宫腺肌病组中P物质的差异表达：子宫腺肌病中P物质 mRNA高于正常对照组(P<0.01)(见图1)。
4.正常对照组和子宫腺肌病组中ER-α的差异表达：子宫腺肌病中ER-α mRNA高于正常对照组(P<0.01)(见图1)。子宫腺肌病中ER-α蛋白表达与正常对照组无明显差异(P =0.315)(见图2)。
5.子宫腺肌病中TRPV1 、P物质和ER-αmRNA表达和疼痛的相关性：子宫腺肌病中TRPV1、P物质和ER-α mRNA表达与疼痛VAS评分存在正相关(Spearman′r=0.548,P<0.01;Spearman′r=0.350,P<0.01;Spearman′r=0.292,P=0.049)(见图3)。在子宫腺肌病组中,TRPV1和ER-α蛋白表达在无-轻度痛经组和中-重度痛经组中无统计学差异(P=0.921,P=0.921)。
图3 子宫腺肌病中TRPV1、P物质和ER-α mRNA表达与疼痛程度之间的关联性分析
(a)子宫腺肌病中TRPV1 mRNA表达与疼痛程度之间正相关;(b)子宫腺肌病中P物质mRNA表达与疼痛程度之间正相关;(c)子宫腺肌病中ER-α mRNA表达与疼痛程度之间正相关。
6.子宫腺肌病中TRPV1、P物质和ER-α mRNA的相关性：在子宫腺肌病病灶中,TRPV1 mRNA和P物质mRNA存在正相关性(Spearman′r=0.350,P=0.012),TRPV1 mRNA和ER-α mRNA之间无相关性(Spearman′r=0.274,P=0.051),P物质 mRNA和ER-α mRNA之间同样存在正相关性(spearman′r=0.559,P<0.01)(见图4)。
图4 子宫腺肌病病灶中TRPV1、P物质和ER-αmRNA表达之间的相关性
(a)子宫腺肌病病灶中TRPV1和P物质mRNA表达之间呈正相关;(b)子宫腺肌病病灶中TRPV1和ER-α mRNA表达之间无相关性;(c)子宫腺肌病病灶中P物质和ER-α mRNA表达之间呈正相关
讨论
本研究发现,TRPV1 mRNA和蛋白在子宫腺肌中的表达高于子宫正常对照,并且TRPV1mRNA和痛经存在正相关,提示TRPV1在子宫腺肌病疼痛有重要作用。已有研究报道TRPV1在内异症中表达升高,但关于子宫腺肌病中TRPV1的表达和作用机制的研究只有一篇报道。Nie等针对子宫腺肌病中TRPV1受体表达进行了临床研究,选取50例子宫腺肌病患者及18例正常对照,发现子宫腺肌病病灶中TRPV1的表达显著增加,且与痛经严重程度呈正相关[2]。上述结果提示TRPV1在子宫腺肌病的发病尤其是疼痛发生发展中存在重要作用。TRPV1参与子宫腺肌病疼痛过程的可能机制如下：(1)在子宫腺肌病炎性环境中,组织和神经损伤后释放多种炎症介质和神经因子至周围组织,引起周围神经元上TRPV1激活后[4],发生钙离子内流,进而导致了神经末梢释放神经肽类和兴奋性氨基酸,完成伤害性感受的传递功能;(2)子宫腺肌病中TRPV1的表达水平增加,其对疼痛的传递作用随之增加;(3)TRPV1是许多炎症途径的下游靶点,受到炎症刺激后的TRPV1激活阈值显著降低,导致痛觉过敏的发生[5];(4)TRPV1还可以激活多种炎症介质和神经肽的分泌,这些物质同样在疼痛的传导功能中起到作用,并且可以反作用激活TRPV1[3,6]。因此,TRPV1在疼痛中的重要作用为慢性盆腔痛的药物研究提供了新的方向。目前已进行了TRPV1靶向治疗的动物实验,国内研究者通过建立子宫腺肌病小鼠模型,对TRPV1拮抗剂——槲皮素的疼痛治疗效果进行验证并取得了阳性结果[7]。但临床药物试验尚未开展,TRPV1靶向治疗对于人类慢性盆腔痛的治疗作用和不良反应尚不明确,还值得进一步探索和研究。
本研究发现,P物质mRNA在子宫腺肌病病灶中表达升高并与痛经程度存在正相关。P物质是广泛参与各种疼痛过程的重要神经递质,当外周神经受到刺激后,P物质可在神经末梢释放并发挥痛觉传递作用[8]。有研究显示将选择性P物质受体激动剂注射进大鼠体内后,可以产生剂量依赖性痛觉过敏;而向已诱发关节炎的大鼠关节内注射P物质受体拮抗剂,发现P物质表达减少,痛觉过敏也明显减轻,提示P物质在痛觉过敏的形成和维持中起到重要作用[9]。P物质在子宫内膜异位症和子宫腺肌病中亦起到重要作用。有研究发现在小鼠内异症病灶中P物质的表达水平较对照组升高[10]。Li等还发现,子宫炎症可以增加P物质阳性且特异性支配子宫的脊髓背角神经元数量,这些神经元数量增加可以诱导和加重疼痛的发生发展[11]。Lertvikool等通过检测P物质表达来代表子宫腺肌病病灶中的神经纤维密度,并发现在子宫腺肌病病灶中,中-重度疼痛组的神经纤维密度要高于轻度疼痛组[12]。这些研究结果均提示P物质可以在子宫腺肌病等疼痛中产生重要作用。
P物质和TRPV1之间存在一定相互促进作用,共同参与子宫腺肌病疼痛的发生发展。既往研究在结肠炎、关节炎等慢性疼痛模型中发现P物质和TRPV1存在相互作用。Lapointe等的研究表明,结肠传入神经长期暴露于P物质后可能产生TRPV1致敏,并引起结肠急性炎症后慢性腹痛的发生[13]。TRPV1和P物质相互作用的机制包括两方面：(1)各种刺激激活初级感觉神经元末梢的TRPV1,引起钙离子内流,胞质内的钙离子浓度增高促使神经末梢中P物质的释放[14];(2)P物质通过阻断TRPV1的降解通路以及促进其再循环至细胞膜,增加背根神经元细胞膜上TRPV1的表达,引起辣椒素诱导产生的电流幅度显著增加[13]。而在子宫腺肌病中,并未有研究对P物质和TRPV1之间的相关性进行探索。本研究发现,子宫腺肌病中P物质mRNA和TRPV1 mRNA之间存在正相关性。P物质可以通过和TRPV1的相互作用参与疼痛的发生发展。基于此作用机制,同样可以对P物质靶向的疼痛治疗进行进一步探索。向患有关节炎大鼠的关节内注射P物质受体拮抗剂,发现P物质表达减少,痛觉过敏也明显减轻[9]。亦有学者提出P物质存在对于TRPV1的诱导激活作用[15]。目前尚无P物质受体拮抗剂在子宫腺肌病模型中的动物实验。
有研究提出雌激素和TRPV1之间可能存在相互作用。Greaves等发现,经E2或雌激素受体激动剂处理后的感觉神经元中TRPV1 mRNA表达增加[16]。雌激素可以从基因表达和受体功能两方面来影响TRPV1受体发挥作用：(1)雌激素与ER结合后,通过与TRPV1 DNA上的反应元件结合,促进TRPV1转录[17];(2)E2与ER、G蛋白偶联雌激素受体(GPER)结合后,促进细胞内钙离子、环磷酸腺苷(Cyclic Adenosine monophosphate,cAMP)增加,激活PKC途径作用于TRPV1受体[17]。但本研究未发现子宫腺肌病病灶中TRPV1 mRNA和ER-αmRNA之间存在正相关性,可能与研究样本量偏小有关。此外,尽管在子宫中ER-α表达高于ER-β,但ER-α的表达情况或许并不能完全替代雌激素的作用情况。
在子宫腺肌病中,雌激素亦可能对P物质间存在一定促进作用,共同参与疼痛过程。本研究发现,子宫腺肌病病灶中P物质 mRNA和ER-α mRNA之间存在正相关性。Mowa等提出,雌激素受体和P物质在感觉神经元上共表达,当卵巢去势大鼠接受外源性雌激素处理后,脊髓背角神经元中的P物质 mRNA合成呈剂量依赖性增加,而这种作用可以被ER阻滞剂阻断[18]。因此在子宫腺肌病中,除了自身和受体结合发挥作用外,雌激素还可能通过促进P物质表达的方式参与疼痛的发展。
因此,基于TRPV1、P物质和ER-α在子宫腺肌病疼痛发生发展中的协同作用,TRPV1的抑制在治疗子宫腺肌病疼痛上可能更具优势,除了直接抑制外周伤害性感受的传递,还可减少外周神经递质,共同减弱疼痛致敏的发生。此外,雌激素抑制治疗,亦能发挥抑制TRPV1的作用。抑制雌激素和TRPV1的双联治疗,或许能够显著的缓解子宫腺肌病患者的疼痛症状。
本研究存在一定的局限性：(1)本研究样本数量较少;(2)由于接受手术的子宫腺肌病患者多数伴有严重的痛经,可能存在一定的选择偏倚。(3)本研究采用VAS评分对患者的痛经程度进行评估,可能存在回忆偏倚,并且对于疼痛的耐受程度,存在个体差异。(4)本研究从mRNA水平发现雌激素受体、P物质和TRPV1受体在子宫腺肌病病灶中表达升高,且和疼痛程度存在正相关性,但尚不能充分证明三者之间的相互作用和调节机制,需要更多对三者的相互调节机制的研究进行补充。
综上,本研究发现TRPV1、P物质和ER-α在子宫腺肌病病中表达升高,与疼痛程度存在正相关性。子宫腺肌病中高雌激素环境促进P物质表达并增加TRPV1 的表达和敏感性,TRPV1和P物质相互促进,不断增强伤害性感受器的作用,导致疼痛敏化。三者相互促进协同,参与疼痛的发生发展。上述结果为子宫腺肌病的疼痛相关机制的进一步研究提供了一些依据,并希望能为子宫腺肌病的疼痛治疗带来一些新的切入点。
1 张瑛,王韵.TRPV1：一种同时参与慢性痛外周敏化和疼痛中枢调制的重要分子.生理学报,2017,69：677-684.
2 Nie J,Liu X,Guo SW.Immunoreactivity of oxytocin receptor and transient receptor potential vanilloid type 1 and its correlation with dysmenorrhea in adenomyosis.Am J Obstet Gynecol,2010,202：346.e1-8.
3 Takayama Y,Tominaga M.Involvement of TRPV1-ANO1 Interactions in Pain-Enhancing Mechanisms.Adv Exp Med Biol,2018,1099：29-36.
4 Dai Y.TRPs and pain.Semin Immunopathol,2016,38：277-291.
5 Hanack C,Moroni M,Lima WC,et al.GABA blocks pathological but not acute TRPV1 pain signals.Cell,2015,160：759-770.
6 Moriyama T,Higashi T,Togashi K,et al.Sensitization of TRPV1 by EP1 and IP reveals peripheral nociceptive mechanism of prostaglandins.Mol Pain,2005,1：3.
7 Nie J,Liu X.Quercetin alleviates generalized hyperalgesia in mice with induced adenomyosis.Mol Med Rep,2017,16：5370-5376.
8 Mantyh PW.Neurobiology of substance P and the NK1 receptor.J Clin Psychiatry,2002,63 Suppl 11：6-10.
9 刘晴晴,刘永哲.P物质在痛觉过敏中作用的研究进展.武警医学,2018,29：916-919.
10 Lian YL,Cheng MJ,Zhang XX,et al.Elevated expression of transient receptor potential vanilloid type 1 in dorsal root ganglia of rats with endometriosis.Mol Med Rep,2017,16：1920-1926.
11 Li J,Micevych P,McDonald J,et al.Inflammation in the uterus induces phosphorylated extracellular signal-regulated kinase and substance P immunoreactivity in dorsal root ganglia neurons innervating both uterus and colon in rats.J Neurosci Res,2008,86：2746-2752.
12 Lertvikool S,Sukprasert M,Pansrikaew P,et al.Comparative study of nerve fiber density between adenomyosis patients with moderate to severe pain and mild pain.J Med Assoc Thai,2014,97：791-797.
13 Lapointe TK,Basso L,Iftinca MC,et al.TRPV1 sensitization mediates postinflammatory visceral pain following acute colitis.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2015,309：G87-99.
14 骆昊,万有,韩济生.辣椒素及其受体.生理科学进展,2003,34：11-15.
15 Jo YY,Lee JY,Park CK.Resolvin E1 Inhibits Substance P-Induced Potentiation of TRPV1 in Primary Sensory Neurons.Mediators Inflamm,2016,2016：5259321.
16 Greaves E,Grieve K,Horne AW,et al.Elevated peritoneal expression and estrogen regulation of nociceptive ion channels in endometriosis.J Clin Endocrinol Metab,2014,99：E1738-1743.
17 Artero-Morales M,González-Rodríguez S,Ferrer-Montiel A.TRP Channels as Potential Targets for Sex-Related Differences in Migraine Pain.Front Mol Biosci,2018,5：73.
18 Mowa CN,Usip S,Storey-Workley M,et al.Substance P in the uterine cervix,dorsal root ganglia and spinal cord during pregnancy and the effect of estrogen on SP synthesis.Peptides：An International Journal,2003,24：761-771.