子痫前期是一种妊娠特异性综合征,国内发病率为5%～12%,主要表现为高血压、蛋白尿及水肿。按疾病的严重程度分为轻度子痫前期及重度子痫前期。按发病时间分为早发型子痫前期和晚发型子痫前期[1-2]。子痫前期是全世界孕产妇和围产儿死亡的主要原因之一。由于其发病背景复杂,发病机制至今尚不明确[3],亦缺乏有效的预测及治疗方法。研究认为,母胎界面免疫耐受失衡与子痫前期的发病有关[4]。唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素6(sialic acid blinding immunoglobulin-like lectin 6,Siglec-6)丰富表达于母胎界面,在调节免疫耐受、滋养细胞分化及浸润等功能中具有重要的作用[5-6]。子宫糖基化蛋白(glycodelin-A)主要表达于蜕膜细胞,是Siglec-6的配体,通过免疫抑制参与胚泡的植入及妊娠维持等[7-8]。目前,Siglec-6及glycodelin-A与子痫前期的发病及妊娠结局的相关性研究报道较少。因此,本研究检测了子痫前期患者血清及胎盘中Siglec-6、Glycodelin-A水平,并分析其与妊娠结局的相关性,期望为该病的预测及临床诊治提供新的思路和方法。
资料与方法
1.一般资料:选取2018年1月到2020年6月于解放军总医院第七医学中心产科收治的子痫前期患者55例作为子痫前期组,其中早发型子痫前期组21例,晚发型子痫前期34例;轻度子痫前期31例,重度子痫前期24例。另外选取同期产科分娩的正常孕妇55例作为对照组。(1)纳入及分组标准。子痫前期诊断依据《妊娠期高血压疾病诊治指南(2020)》[9],轻度子痫前期是指妊娠20周后出现血压≥140/90 mmHg,伴有24 h尿蛋白≥0.3 g,或尿蛋白/肌酐≥0.3,或随机尿蛋白(+);重度子痫前期是指血压≥160/110 mmHg,伴有24 h尿蛋白>2 g,或孕妇其他器官功能受累或出现胎盘胎儿并发症。早发型子痫前期是指妊娠<34周发病者;晚发型子痫前期是指妊娠≥34周发病者。(2)排除标准。伴有其他妊娠合并症或并发症者。两组间年龄、孕次、孕周、体重指数比较,差异均无统计学意义,均为单胎、初产妇,见表1。所有研究对象对本研究知晓,并签署知情同意书。
表1 两组间一般资料比较
组别例数年龄(岁)孕周(周)孕次(次)体重指数(kg/m2)子痫前期组5530.1±3.336.6±3.62.2±0.427.4±2.6正常对照组5529.6±2.837.1±4.12.1±0.227.2±2.5
二、方法
1.标本采集及处理:所有研究对象(子痫前期组于治疗前采血)均于清晨空腹抽取静脉血5 mL,以3 000 r/min的速度离心15 min,吸取上清液放入冻存管中,-70℃储存备用。另外,所有研究对象在胎盘娩出后,立即在母体面的中央区域取大小约 1.5 cm3的组织,放入4%的甲醛溶液中固定 24 h后制作蜡块,连续切片,厚度为5 um,制成贴片备用。
2.测定方法:采用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法测定血清中Siglec-6、Glycodelin-A水平,试剂盒分别购自北京诺为生物技术有限公司和武汉华美生物科技有限公司,检测灵敏度分别为0.05 ng/mL、0.1 ng/mL。胎盘Siglec-6、Glycodelin-A检测采用免疫组织化学SABC 法。特异性兔抗人Siglec-6抗体及特异性兔抗人Glycodelin-A抗体均由上海圻明生物科技有限公司提供,工作浓度为 1:100。
3.免疫组化的结果判定:由两名专业人员盲法判读。以细胞浆或细胞膜中出现棕黄色或浅黄色染色为阳性,以与背景颜色相同或无着色为阴性。随机选取5个高倍视野对每例切片进行分析,将阳性细胞数的百分比与染色强度结合起来进行综合计分。阳性细胞数百分比得分分别为,0分为<5%,1分为5 %～25 %,2分为26 %～50 %,3分为>50 %;染色强度得分分为,0分为无色或与背景色一致,1分为淡黄色,2分为棕黄色,3分为棕褐色;将两项得分相乘后为最终结果,即(-)为0～1分,(+)为 2～3分,(++)为4～5分,(+++)为≥6分。
4.妊娠结局随访:随访所有研究对象的妊娠结局,时间截点为妊娠终止。包括母体不良妊娠结局,包括胎盘早剥、胎儿生长受限、产后出血、胎儿窘迫;胎儿或新生儿不良妊娠结局,包括低出生体重儿、新生儿窒息、新生儿死亡。
5.统计学处理:采用SPSS22.0软件进行。计量资料以
表示,组间比较采用t检验;计数资料以百分比表示,组间比较采用χ2检验。相关分析采用Spearman及Pearson相关分析。P<0.05为差异具有统计学意义。
结果
1.两组孕妇血清中Siglec-6、Glycodelin-A水平比较:子痫前期组血清中Siglec-6水平明显高于对照组,Glycodelin-A水平明显低于对照组,组间差异均有统计学意义。见表2。
表2 两组孕妇血清中Siglec-6、Glycodelin-A水平比较
组别例数Siglec-6(ng/mL)Glycodelin-A(pg/mL)子痫前期组551.23±0.25∗125.88±26.91∗正常对照组550.55±0.08167.32±28.06
与正常对照组比较,*P<0.01
2.轻度与重度子痫前期患者血清中Siglec-6、Glycodelin-A水平比较:重度子痫前期患者血清中Siglec-6水平显著高于轻度子痫前期组,而Glycodelin-A水平显著低于轻度子痫前期组,组间差异均有统计学意义。见表3。
表3 轻度与重度子痫前期患者血清中Siglec-6、Glycodelin-A水平比较
组别例数Siglec-6(ng/mL)Glycodelin-A(pg/mL)重度子痫前期组241.46±0.28∗114.27±25.79∗轻度子痫前期组311.05±0.13136.42±27.85
与轻度子痫前期组比较,*P<0.01
3.早发型与晚发型子痫前期患者血清中Siglec-6、Glycodelin-A水平比较:早发型子痫前期组血清中Siglec-6水平明显高于晚发型子痫前期组,Glycodelin-A水平明显低于晚发型子痫前期组,组间差异均有统计学意义。见表4。
表4 早发型与晚发型子痫前期患者血清中Siglec-6、Glycodelin-A水平比较
组别例数Siglec-6(ng/mL)Glycodelin-A(pg/mL)早发型子痫前期组211.53±0.31∗109.93±23.65∗晚发型子痫前期组341.37±0.22130.08±29.17
与晚发型子痫前期组比较,*P<0.05
4.各组孕妇胎盘中Siglec-6、Glycodelin-A水平比较:胎盘中Siglec-6主要表达于滋养细胞中,部分表达于蜕膜细胞;Glycodelin-A主要表达于蜕膜细胞,少部分表达于滋养细胞。两者均表达于细胞浆与细胞膜。见图1。
A:滋养细胞中Siglec-6表达阳性;B:蜕膜细胞中Siglec-6表达阳性;C:蜕膜细胞中Glycodelin-A表达阳性;D:滋养细胞中Glycodelin-A表达阳性
图1 各组孕妇胎盘中Siglec-6、Glycodelin-A的表达(免疫组织化学SABC 法,×100)
子痫前期组胎盘组织中Siglec-6表达强度明显高于正常对照组(P<0.01),且重度子痫前期明显高于轻度子痫前期组(P<0.05),早发型子痫前期组明显高于晚发型子痫前期组(P<0.05)。子痫前期组胎盘组织中Glycodelin-A表达强度明显低于正常对照组(P<0.05),且重度子痫前期明显低于轻度子痫前期组(P<0.05),早发型子痫前期组明显低于晚发型子痫前期组(P<0.05)。见表5。
表5 各组间胎盘组织中Siglec-6、Glycodelin-A表达强度的比较
组别例数Siglec-6-++++++阳性率(%)Glycodelin-A-++++++阳性率(%)对照组5538105230.91810121567.3子痫前期组55209111563.6∗3097945.5∗ 轻度子痫前期311564651.61365758.1 重度子痫前期24537979.2∗∗1732229.2∗∗ 早发型子痫前期214341081.0∗∗∗1532128.6∗∗∗ 晚发型子痫前期341667552.91565855.9
与对照组比较,*P<0.05;与轻度子痫前期组比较,**P<0.05;与晚发型子痫前期比较,***P<0.05
5.相关性研究:子痫前期组血清及胎盘中Siglec-6与Glycodelin-A水平均呈负相关(r=-0.503,P<0.05;r=-0.512,P<0.05)。采用Spearman相关分析(根据妊娠结局给予赋值,不良妊娠结局=1,妊娠结局良好=0),结果显示子痫前期组血清中Siglec-6水平与不良妊娠结局呈正相关(r=0.496,P<0.05),而Glycodelin-A水平与不良妊娠结局呈负相关(r=-0.487,P<0.05)。
讨论
Siglec-6是唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素家族的成员之一,又称CD327。Siglec-6特异性的表达于人类胎盘,妊娠早期主要高表达于细胞滋养细胞和合体滋养细胞中,随着妊娠周数的增加,其表达量逐渐下降[6]。Siglec-6通过与其配体瘦蛋白和Glycodelin-A结合,以自分泌或旁分泌的方式发挥功能。研究发现,Siglec-6在母胎界面免疫耐受和妊娠的维持方面有重要的作用,并参与调控滋养细胞的侵袭、凋亡过程,可能与流产、子痫前期等妊娠并发症有关[10]。
Awoyemi等[6]研究发现,Siglec-6可表达于胎盘细胞裂解物及合体滋养细胞外囊泡中,且子痫前期组Siglec-6的表达水平明显高于正常妊娠组。本研究结果显示,Siglec-6主要表达胎盘滋养细胞,部分表达于蜕膜细胞,且子痫前期组明显高于正常对照组,重度子痫前期组明显高于轻度子痫前期组,早发型子痫前期组明显高于晚发型子痫前期组(P均<0.05),提示胎盘中Siglec-6水平的升高可能与子痫前期的发生及病情发展有关。有研究报道[11],Siglec-6可抑制人脐静脉内皮细胞的增殖及迁移,促进其凋亡,同时促进炎性因子TNF-α、IL-6的释放,抑制VEGF的分泌,导致人脐静脉内皮细胞的损伤,诱发子痫前期。另外,Siglec-6可能通过抑制PI3K-AKT通路,发挥抑制滋养细胞侵蚀、浸润能力,导致胎盘浅浸润,从而导致子痫前期的发生。本研究还发现,子痫前期患者及正常妊娠孕妇血清中均有Siglec-6的低水平表达,但子痫前期组明显高于正常妊娠组,且随病情加重,表达水平逐渐升高,另外早发型子痫前期组高于晚发型子痫前期组,这与Tarca等[12]的研究结果相一致。值得注意的是,有学者采用Western blotting方法检测了子痫前期患者血清中Siglec-6的表达情况,结果并未检测到其表达[9],推测原因可能为选择的Siglec-6抗体不同,进而识别的蛋白亚型不同所致。本研究还发现,子痫前期组血清中Siglec-6水平与不良妊娠结局呈正相关,提示血清中Siglec-6水平可作为评估子痫前期病情轻重及不良妊娠结局的临床参考指标。
Glycodelin-A是由一种由子宫内膜合成的糖蛋白,最早在羊水中发现,分子量约为28KD,其蛋白质部分由180个氨基酸组成,具有4个糖链[13]。Glycodelin-A的合成和分泌受孕激素、人绒毛膜促性腺激素、松弛素等调节,具有免疫抑制、胚泡植入和妊娠维持、调节滋养细胞浸润、介导细胞黏附、参与胎盘血管形成等功能[14],可能与子痫前期的发生有一定的关系。
本研究结果表明,Glycodelin-A主要表达于胎盘蜕膜细胞,部分表达于滋养细胞,子痫前期组表达量明显低于正常妊娠组,且重度子痫前期组低于轻度子痫前期组,早发型子痫前期组低于晚发型子痫前期组(P均<0.05),提示Glycodelin-A参与了子痫前期的发病,并与病情严重程度有关。其可能机制如下:(1)Glycodelin-A可降低母胎界面的Th1/Th2值,从而抑制免疫排斥反应,保障囊胚的发育,促进滋养细胞侵袭及子宫螺旋动脉的重铸,而Glycodelin-A的低表达导致局部炎症反应加重,滋养细胞侵袭功能受抑制,进而造成胎盘浅着床,引发子痫前期[15]。(2)Glycodelin-A能促进血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)及其受体的表达,诱导胎盘血管的生成,Glycodelin-A低表达导致VEGF表达降低,胎盘血管生成障碍,血管内皮细胞受损,通透性增加,血管痉挛,出现高血压及蛋白尿[16]。本研究结果还发现,子痫前期患者血清中Glycodelin-A水平明显低于正常妊娠组,且随病情加重,血清中水平逐渐降低,早发型子痫前期低于晚发型子痫前期组(P均<0.05);另外,血清中Glycodelin-A水平与不良妊娠结局呈负相关(P<0.05),提示血清中Glycodelin-A水平可以反映子痫前期病情的轻重,可能作为一个预测及监测病情变化、评估妊娠结局的指标应用于临床。
本研究显示,子痫前期组血清及胎盘中Siglec-6与Glycodelin-A水平均呈负相关,提示两者在子痫前期的发病中起着拮抗作用。Lam等[17]研究发现Siglec-6与其配体Glycodelin-A结合,通过沉默ERK/c-Jun通路,抑制滋养细胞的侵蚀能力,导致胎盘浅浸润,从而引发子痫前期,其具体机制仍待深入探讨。
总之,Siglec-6、Glycodelin-A与子痫前期的发生、发展密切相关,两因子能否成为该病及不良妊娠结局的预测指标、人为地干预两因子的表达能否成为干预治疗该病的方法,尚需进一步研究。
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