妊娠期肝内胆汁淤积症(intrahepatic cholestasis of pregnancy,ICP)是一种在妇女妊娠中、晚期特有并发症,属于肝脏疾病范畴[1],可以表现出不同程度皮肤瘙痒、黄疸等症状[2]。ICP发病率约为0.1%～15.6%,血清总胆汁酸是诊断的敏感指标,多数ICP预后良好,对于孕妇自身健康来说威胁性不大,相关症状在妊娠期结束后便会消失,但胆汁酸升高引发的代谢毒性会增加早产、胎死宫内、剖宫产、羊水粪染等围生儿不良结局的发生率,严重影响孕妇及胎儿健康[3-4]。miR-155是一种长度仅有19～25个核苷酸非编码RNA,其表达水平在子宫内膜癌和多囊卵巢综合征患者中会明显上升,造成妇女不孕,是不良妊娠结局的危险因素[5]。胰岛素样生长因子结合蛋白-3(Insulin-like growth factor binding protein-3,IGFBP-3)是ICP的敏感指标,肝脏是IGFBP-3 主要合成与分泌场所,其水平在ICP产妇中波动较大[6]。基于此本研究在ICP产妇miR-155、IGFBP-3表达水平上探讨其与妊娠结局的关系,旨在为今后临床有效预防不良妊娠结局提供一定参考依据。
对象与方法
1. 研究对象:回顾性选取2019年1月—2021年9月在本院收治的50例ICP产妇纳入ICP组,另随机选择同期本院进行产前检查的50例健康产妇作为对照组。纳入标准:(1)纳入ICP组产妇均符合第九版《妇产科学》中ICP相关诊断标准[7]:血清总胆汁酸≥40 μmol/L,瘙痒严重伴或不伴黄疸、皮肤抓痕;(2)单胎妊娠;(3)ICP产妇病情可控;(4)自然受孕。排除标准:(1)肝、肾、心、脑等部位存在严重病变;(2)合并恶性肿瘤;(3)精神及语言存在障碍,无法正常沟通;(4)研究对象在妊娠前自身存在严重免疫性疾病或急慢性病。
2.研究方法:
(1)根据研究目的和研究内容,收集两组临床资料,包括年龄、体质指数(Body Mass Index,BMI)、受孕次数、平均孕周及妊娠结局等信息。统计两组妊娠结局情况,包含早产(自发性和医源性),胎儿窘迫、羊水污染、低出生体重、新生儿窒息。
(2)采用实时荧光定量 PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)技术对两组研究对象外周血及胎盘组织miR-155、IGFBP-3基因表达水平进行检测。所有研究对象均于入院后分娩前清晨进行空腹静脉采集外周血样3 mL,高速离心后,保留血清,放于-20 ℃冰箱中保存用于后续检测。孕妇分娩完成后,使用生理盐水对胎盘进行冲洗,在母体面中央连接脐带处剪取胎盘组织,剪取过程需避开羊膜层、出血点及钙化区,每块组织体积约为1 cm3。将组织块放入-80 ℃冰箱进行冻存。通过RNA提取试剂盒(TSP413,北京擎科生物科技有限公司)提取总RNA,随后通过逆转录试剂盒(TSK311S,北京擎科生物科技有限公司)将RNA逆转录成cDNA,然后通过q-PCR试剂盒(10200ES60,翌圣生物科技上海有限公司)以cDNA为模板对目的基因进行实时荧光定量检测,q-PCR扩增条件:95 ℃预变性5 min,95 ℃变性10 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共35个循环。采用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量,各目的基因引物序列见表1。以上所有操作均按照试剂盒说明书严格进行。
表1 目的基因上下游引物序列
基因 引物序列 miR-155 上游 5′-TTGAATTCTAACACCTTCGTGGCTACAGAG-3′ 下游 5′-TTAGATCTCATTTATCGAGGGAAGGATTG -3′ IGFBP-3 上游 5′- GATGGGTTACCTGCCGACTG-3′ 下游 5′- TCTTCCCACAGTCCCAACGG-3′ GAPDH 上游:5′-CTGACATGCCGCCTGGAGA-3′ 下游 5′-ATGTAGGCCATGAGGTCCAC-3′
(3)采用全自动化生化分析仪测定两组研究对象外周血清中总胆汁酸(total bile acid,TBA)、总胆红素(total bilirubin,TBIL)、直接胆红素(direct bilirubin,DBIL)、谷丙转氨酶(glutamic-pyruvic transaminase,ALT)水平进行检测。
(4)根据分娩结局,将研究对象分为不良妊娠结局组和良好妊娠结局组,比较两组血清miR-155、IGFBP-3表达水平比较。不良妊娠结局包括早产(自发性和医源性),胎儿窘迫、羊水污染、低出生体重、新生儿窒息。
3. 统计学分析:应用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析,满足正态分布且方差齐的时候采用
表示,组间计量资料采用独立t检验比较差异;计数资料采用例和百分率表示,比较采用χ2检验或Fisher精确概率检验;采用Pearson相关系数分析ICP组血清TBA、DBIL、TBIL水平和miR-155、IGFBP-3基因表达水平的相关性;采用受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析miR-155 mRNA和IGFBP-3 mRNA对不良妊娠结局预测价值,曲线下面积(area under the curve,AUC)表示预测的准确度,以P<0.05为差异有统计学意义。
结果
1. 两组产妇临床资料比较:两组年龄、BMI、平均孕周、受孕次数和分娩次数等一般资料比较无统计学差异(P>0.05),结果具有可比性。见表2。
表2 比较两组临床资料
组 别 例 数 年 龄 ( 岁 ) B M I ( k g / m 2 ) 平 均 孕 周 ( 周 ) 受 孕 次 数 ( 次 ) 分 娩 次 数 [ 例 ( % ) ] 初 产 妇 经 产 妇 对 照 组 5 0 2 8 . 5 ± 3 . 2 2 3 . 1 ± 1 . 3 3 7 . 5 ± 0 . 5 2 . 1 ± 0 . 5 2 8 ( 5 6 . 0 ) 2 2 ( 4 4 . 0 ) I C P 组 5 0 2 9 . 1 ± 3 . 9 2 3 . 5 ± 1 . 2 3 7 . 8 ± 0 . 6 2 . 2 ± 0 . 5 3 1 ( 6 2 . 0 ) 1 9 ( 3 8 . 0 )
2. 两组miR-155、IGFBP-3基因表达水平情况:ICP组外周血清及胎盘组中miR-155基因表达水平明显高于对照组,而IGFBP-3基因表达水平均低于对照组(P<0.05)。见表3。
表3 两组miR-155、IGFBP-3表达水平比较
组别 例数 血清 miR-155 ∗ IGFBP-3 ∗ 胎盘组织 miR-155 ∗ IGFBP-3 ∗ 对照组 50 0. 4±0. 1 1. 3±0. 3 0. 5±0. 1 1. 3±0. 3 ICP 组 50 0. 6±0. 1 0. 7±0. 2 0. 6±0. 1 0. 7±0. 2
注:两组比较,*P<0.05
3. 两组外周血清中TBA、DBIL及TBIL水平比较:ICP组外周血清中TBA、TBIL、DBIL及ALT水平均明显高于对照组(P<0.05)。见表4。
表4 两组肝功能相关指标表达水平比较
组别 例数 TBA (μmol / L) ∗ TBIL (μmol / L) ∗ DBIL (μmol / L) ∗ ALT (U/ L) ∗ 对照组 50 8. 5±2. 9 12. 1±3. 3 5. 4±1. 6 29. 3±8. 5 ICP 组 50 15. 6±4. 1 19. 2±5. 9 8. 6±2. 3 135. 5±38. 6
注:两组比较,*P<0.05
4. 两组不良妊娠结局发生情况:ICP组早产、羊水污染、低出生体重发生率均明显高于对照组(P<0.05)。见表5。
表5 两组妊娠结局对比 [例(%)]
组 别 例 数 早 产 ∗ 胎 儿 窘 迫 # 羊 水 污 染 ∗ # 低 出 生 体 重 ∗ # 新 生 儿 窒 息 ∗ # 对 照 组 5 0 2 ( 4 . 0 ) 0 ( 0 . 0 ) 0 ( 0 . 0 ) 1 ( 2 . 0 ) 1 ( 2 . 0 ) I C P 组 5 0 8 ( 1 6 . 0 ) 2 ( 4 . 0 ) 6 ( 1 2 . 0 ) 8 ( 1 6 . 0 ) 3 ( 6 . 0 )
注:两组比较,*P<0.05;#采用Fisher精确概率检验
5.ICP组血清 miR-155、IGFBP-3表达水平与肝功能指标相关性分析:血清TBA、TBIL、DBIL及ALT水平均与miR-155表达水平呈正相关,与IGFBP-3表达水平呈现负相关(P<0.05)。见表6。
表6 ICP组血清 miR-155、IGFBP-3水平与肝功能指标相关性
miR-155 r P 95%CI IGFBP-3 mRNA r P 95%CI TBA 0. 297 0. 003 0. 107～ 0. 466 -0. 252 0. 011 -0. 4. 27～ -0. 058 TBIL 0. 224 0. 025 0. 028～ 0. 402 -0. 368 <0. 001 -0. 527～ -0. 185 DBIL 0. 238 0. 017 0. 043～ 0. 415 -0. 284 0. 004 -0. 455～ -0. 092 ALT 0. 345 0. 001 0. 159～ 0. 507 -0. 233 0. 020 -0. 410～ -0. 038
6.不良妊娠结局组和良好妊娠结局组血清miR-155、IGFBP-3表达水平比较:50例产妇有16例出现不良妊娠结局。不良妊娠结局组血清miR-155高于良好妊娠组,IGFBP-3低于良好妊娠组(P<0.05)。见表7。
表7 比较不良妊娠结局组和良好妊娠结局组血清miR-155、IGFBP-3表达水平
组 别 例 数 m i R - 1 5 5 ∗ I G FB P - 3 ∗ 不 良 妊 娠 结 局 组 1 6 0 . 6 ± 0 . 1 0 . 6 ± 0 . 1 良 好 妊 娠 结 局 组 3 4 0 . 5 ± 0 . 1 0 . 8 ± 0 . 1
注:两组比较,*P<0.05
7. 血清miR-155、IGFBP-3表达水平对不良妊娠结局预测价值:血清miR-155、IGFBP-3 mRNA预测不良妊娠结局的AUC分别为0.736、0.796(P<0.05)。见图1、表8。
图1 miR-155、IGFBP-3 mRNA预测不良妊娠结局ROC曲线
表8 miR-155、IGFBP-3 mRNA预测不良妊娠结局的ROC特征
检测方法 AUC 敏感度 (%) 特异性 (%) 95%CI P miR-155 0. 736 88. 0 74. 0 0. 639～ 0. 834 <0. 001 IGFBP-3 mRNA 0. 796 70. 0 64. 0 0. 704～ 0. 888 <0. 001
讨论
在临床妇产科中,ICP是一种常见病症,胆汁酸水平上升是ICP产妇主要病理现象,主要发生在孕妇妊娠期中、晚期且发病率较高[8]。ICP症状如果不能得到及时缓解,会导致孕妇出现新生儿窒息、低出生体重、胎儿窘迫等不良妊娠结局,对围生儿生命健康造成巨大危害。因此,如何快速找到ICP产妇不良妊娠结局的诱因,并对产妇进行疾病预防和治疗是临床医生所面临的巨大挑战。
研究发现在多种疾病发生、发展中miRNA都参与其中,其水平会随着患者疾病进展发生改变 [9-10]。本研究中,ICP产妇的miR-155水平明显上升,而IGFBP-3表达水平明显降低,提示miR-155和IGFBP-3可能参与了ICP发生过程。miR-155与很多妇科疾病都存在密切联系,miR-155高表达可以促进宫颈癌和乳腺癌疾病恶化及淋巴结转移,可以引发妇女流产,同时还可以通过调控血管生长因子产生参与妊娠并发症发生过程[11-12]。 IGFBP-3 是 IGF家族中成员之一,是妊娠晚期孕妇中丰富度最高一种结合蛋白,其水平会随着孕期延长而增加[13]。Liao [14]等人认为妊娠晚期子痫前期产妇血清中IGFBP-3水平会明显上调,对于妊娠合并子痫前期具有一定诊断价值。殷欣欣[15]等人也通过研究证实胎盘组织中 IGFBP-3表达水平降低会造成胎儿生长受限,引发不良妊娠结局。研究表明在肝细胞癌中,miR-155可以抑制IGFBP-3表达来促进疾病发生、进展[16]。基于此,推测在ICP产妇中也存在相似调控方式。
TBA、TBIL、DBIL及ALT均属于肝功能指标,其表达水平在一定程度上可以反映出ICP发病风险以及不良妊娠结局。本研究结果发现ICP组产妇TBA、TBIL、DBIL及ALT水平均明显高于对照组。对两者不良妊娠结局进行统计对比,发现ICP组早产、羊水污染、低出生体重发生率均明显高于对照组,以上研究结果与金嫔嫔[17]、谢之芳[18]等人研究结果相似。分析其原因可能是因为ICP 孕妇建议终止妊娠时间为34～39周,较正常孕妇早,因此早产发生率较对照组高。孕妇在妊娠中、晚期其机体大量分泌雌激素,使得胆酸代谢出现障碍,进而导致肝脏功能受到损伤,无法畅通将胆盐排泄出去,最终使胆汁大量淤积在肝中,而后胆酸会通过胎盘向胎儿区域进行扩散,使得胆汁酸盐在胎盘沉积,使绒毛间隙变窄影响胎儿氧供,导致胎儿生长受限,低出生体重发生率显著增加。此外,胆汁酸还可以促进胎儿肠蠕动,引起胎粪排泄,使羊水污染率增加,诱发 ICP 孕妇提前分娩[19]。为了进一步探究miR-155、IGFBP-3表达水平与不良妊娠结局关系,本研究分别对ICP组血清miR-155 mRNA、IGFBP-3 mRNA与TBA、DBIL、TBIL、ALT水平进行相关性分析,发现上述肝功能指标与miR-155 mRNA呈正向关,与IGFBP-3 mRNA水平呈负相关,且miR-155 mRNA和IGFBP-3 mRNA对不良妊娠结局具有一定预测价值。IGFBP-3为妊娠晚期胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1,IGP-1)的主要结合蛋白,IGFBP-3水平降低可引起IGF-1结合率降低,降低IGF-1生物利用度,增加胎儿并发症,而IGFBP-3水平降低还可促进胆汁酸分泌增加,增加围生儿不良结局发生率。究其原因可能是,miR-155水平上调后抑制了IGFBP-3 表达,当IGFBP-3 表达水平受到抑制后导致胰岛素样生长因子-2活性降低,阻碍了胆汁排泄,导致胆汁在肝脏中积累进一步加重,进而造成不良妊娠结局发生。基于本研究推测miR-155可能通过下调IGFBP-3表达,促进胆汁酸分泌参与ICP的发生发展,其具体作用机制还需进一步研究。相比于传统血清总胆汁酸预测ICP预后,本文通过miR-155和IGFBP-3不仅可有效预测ICP预后,但能避免血清总胆汁酸升高增加产妇不良结局。
综上所述,ICP产妇血清及胎盘中miR-155 和IGFBP-3 表达水平具有较好一致性,且与妊娠结局存在一定相关性,其可能通过调节肝功能指标变化进而影响ICP预后不良结果。但由于本文纳入临床样本量较小,需扩大样本量进一步研究分析。在临床中可以考虑对ICP产妇血清中miR-21、IGFBP-3 水平的检测来预测不良妊娠结局发生风险,为治疗方案的合理制定及实施提供思路,以此降低ICP产妇不良妊娠结局发生。
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