妊娠期高血压疾病是妊娠期间出现血压升高的一组疾病,可引起弥散性血管内凝血、胎盘早剥、胎儿宫内生长受限等不良妊娠结局[1]。该病发生于妇女妊娠 20 周以后,一般在产后 12 周恢复,是妊娠期女性特有的疾病。国外的发病率在7%以上,而中国的发病率高达9%以上,是严重威胁孕妇和围生儿发病及死亡的主要因素之一[2]。该病是由于多种因素引起的复杂疾病,发病与遗传易感性、免疫调节、氧化应激和胎盘的浅表植入等有关,除此也与年龄、家族妊娠期高血压疾病史等密切相关[3]。尽管对该病进行了大量的研究,但潜在的机制尚不明确,目前结果只倾向自身遗传和外界环境互相作用导致了妊娠期高血压疾病的发生[4]。DICER基因的多态性可能改变机体器官生物学功能,并在各种疾病的发展中起着至关重要的作用,包括自发性流产和中风等[5]。RAN 蛋白调节多种细胞过程,在妊娠妇女血浆中RAN蛋白表达量升高,RAN 蛋白可能在妊娠期高血压疾病的发展中起着一定的作用[6]。基于上述,本研究选取DICER1 rs13078和RAN rs3803012位点,通过检测妊娠期高血压疾病患者和分娩正常的孕妇外周血中DICER1 rs13078和RAN rs3803012位点的基因分型,探讨其与妊娠期高血压疾病的相关性。
对象与方法
1. 研究对象:选取2021年6月至2022年3月在本院住院单胎妊娠且诊断为妊娠期高血压疾病的患者321例作为研究对象,其中妊娠期高血压患者147例(妊娠期高血压组),子痫前期患者174例(子痫前期组)。同时选取同期在本院分娩正常的孕妇180例作为对照组。纳入标准:(1)年龄≥18 岁;(2)自然受孕;(3)单胎妊娠;(4)新生儿存活,无畸形。(5)病例组依据《妇产科学》第九版妊娠期高血压诊断标准纳入,妊娠期高血压患者定义为收缩压≥140 mmHg,舒张压≥90 mmHg,妊娠 20 周后,尿蛋白检测为阴性。子痫前期患者定义为收缩压≥140 mmHg,舒张压≥90 mmHg,24 h尿蛋白≥0.3 g,血小板减少或者肝肾功能受损等,但不包括合并慢性高血压的患者。排除标准:(1)合并恶性肿瘤、自身免疫性疾病的患者;(2)应用抗血小板药物干扰的患者;(3)合并急慢性肝肾功能疾病的患者;(4)近期发生急性、慢性感染者;(5)妊娠不足28周分娩的患者。本研究通过本医院伦理委员会审批,编号:伦审(2021)-19号。
2.研究方法:
(1)临床资料收集。收集研究对象的相关临床资料,包括年龄、孕周、收缩压、舒张压、胎儿性别、糖尿病史、妊娠高血压病史等。
(2)样本采集。妊娠20周后,无菌条件下采集研究对象的外周血样本5 mL,置于EDTA抗凝管中,4 ℃冰箱保存,24 h后进行DNA提取。
(3)聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)基因测定。使用小量全血基因组DNA提取试剂盒(瑞士Roche公司)提取外周血的DNA,采用UV-260分光光度计(日本SHIMADZU公司)检测DNA 纯度和浓度,采用PCR-RFLP技术对基因进行分型检测。DICER1基因 rs13078位点的正向引物:5′-GTGCTCTGAATCACTAATGGT-3′,反向引物:5′-TGTGACCGTAGTAGCATGGAATTC-3′,RAN基因rs3803012位点的正向引物:5′-GTATCGCTAATCG TCTACGGGT-3′,反向引物:5′-TATGGTCATCGTC AGCATCGTGTC-3′。PCR反应体系为:2 μL的 dNTP混合物,正向引物和反向引物各1 μL,2 μL 10xBuffer,1.0 μL DNA,0.3 μL的TaqDNA聚合,12.7μL的三蒸水。PCR反应条件为95 ℃ 15 min,95 ℃ 15 min,72 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,终止反应,循环35次。使用琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒切胶纯化对PCR产物。最后采用测序仪对基因进行测序分型。
3.统计学处理:采用SPSS 23.0软件处理,计数资料采用例数(%)表示,行χ2检验,计量资料采用均数±标准差
表示,组间比较采用t检验或单因素方差分析,Logistic 回归分析妊娠期高血压疾病发病的危险因素;P<0.05差异有统计学意义。
结果
1.三组患者的临床资料对比:三组孕妇分娩的胎儿性别比较,差异无统计学意义(P>0.05);妊娠期高血压组和子痫前期组的年龄显著高于对照组(P<0.05),妊娠期高血压组和子痫前期组的分娩孕周低于对照组(P<0.05),收缩压和舒张压高于对照组,糖尿病史和家族妊娠期高血压疾病史占比明显高于对照组(P<0.05)。见表1。
表1 三组患者的临床资料对比分析
组别 对照组 (n = 180) 妊娠期高血压组 (n = 147) 子痫前期组 (n = 174) 年龄(岁) 22. 6±3. 9 29. 3±5. 3 ∗ 29. 4±5. 5 ∗ 孕周(周) 39. 1±2. 9 36. 6±3. 5 ∗ 36. 2±3. 7 ∗ 收缩压(mmHg) 113. 7±10. 3 146. 2±17. 2 ∗ 147. 2±17. 5 ∗ 舒张压(mmHg) 75. 1±7. 6 98. 5±12. 7 ∗ 98. 5±12. 9 ∗ 胎儿性别 [例(%)] 男 29(48. 3) 23(46. 9) 27(46. 6) 女 31(51. 7) 26(53. 1) 31(53. 4) 糖尿病史[例(%)] 是 2(3. 3) 9(18. 4) ∗ 8(13. 8) ∗ 否 58(96. 7) 40(81. 6) 50(86. 2) 家族妊娠期高血压 疾病史[例(%)] 是 1(1. 7) 4(8. 2) ∗ 7(12. 1) ∗ 否 59(98. 3) 45(91. 8) 51(87. 9)
注:与对照组相比,*P<0.05.
2. DICER1 rs13078和RAN rs3803012位点多态性分析:对照组、妊娠期高血压组和子痫前期组DICER1 rs13078位点有T和A两种基因,TT、TA、AA三种基因型,见图1A;对照组、妊娠期高血压组和子痫前期组RAN rs3803012位点有A和G两种基因,AA、AG、GG三种基因型,见图1B。
注:图1A:1、3、4为rs13078位点TT;2为rs13078位点AA;5为TA;图1B:1、4、5为rs3803012位点AA;2为rs3803012位点GG;3为rs3803012位点AG
图1 DICER1 rs13078和RAN rs3803012位点多态性切割位点
3. Hardy-Weinberg平衡检验:对照组、妊娠期高血压组和子痫前期组DICER1 rs13078和RAN rs3803012位点基因型的实际值和预测值均符合Hardy-Weinberg平衡检验(P>0.05),说明三组样本均具有较好的代表性,见表2和表3。
表2 DICER1 rs13078位点基因型 Hardy-weinberg平衡检验
组 别 例 数 T T 实 际 值 预 测 值 T A 实 际 值 预 测 值 A A 实 际 值 预 测 值 对 照 组 1 8 0 1 6 2 1 5 9 1 2 1 8 6 3 妊 娠 期 高 血 压 组 1 4 7 1 1 1 1 1 4 3 3 2 7 3 6 子 痫 前 期 组 1 7 4 1 3 8 1 3 2 3 3 3 6 3 6
表3 RAN rs3803012基因型 Hardy-weinberg平衡检验
组 别 例 数 A A 实 际 值 预 测 值 A G 实 际 值 预 测 值 G G 实 际 值 预 测 值 对 照 组 1 8 0 1 7 1 1 6 8 9 6 0 6 妊 娠 期 高 血 压 组 1 4 7 1 3 2 1 3 5 1 5 9 0 3 子 痫 前 期 组 1 7 4 1 3 5 1 2 6 3 9 4 5 0 3
4. DICER1 rs13078和RAN rs3803012位点的基因分布情况:对照组、妊娠期高血压组和子痫前期组DICER1 rs13078和RAN rs3803012位点基因型基因分布情况比较,差异具有统计学意义(P<0.05),见表4。
表4 DICER1 rs13078和RAN rs3803012位点的基因分布频率
组 别 例 数 D I C E R 1 r s 1 3 0 7 8 ∗ T T T A A A R A N r s 3 8 0 3 0 1 2 ∗ A A A G G G 对 照 组 1 8 0 1 6 2 ( 9 0 . 0 ) 1 2 ( ( 6 . 8 ) 6 ( 3 . 3 ) 1 7 1 ( 9 5 . 0 ) 9 ( 5 . 0 ) 0 ( 0 . 0 ) 妊 娠 期 高 血 压 组 1 4 7 1 2 4 ( 8 4 . 4 ) 2 3 ( 1 5 . 7 ) 3 ( 2 . 0 ) 1 0 8 ( 7 3 . 5 ) 3 9 ( 2 6 . 5 ) 0 ( 0 . 0 ) 子 痫 前 期 组 1 7 4 1 2 1 ( 6 9 . 5 ) 5 3 ( 3 0 . 5 ) 3 ( 1 . 7 ) 1 5 9 ( 9 1 . 4 ) 1 5 ( 8 . 6 ) 0 ( 0 . 0 )
注:组间比较,*P<0.05
5. DICER1 rs13078和RAN rs3803012位点与妊娠期高血压疾病发病的相关性:以是否发生妊娠期高血压和子痫前期为因变量,以DICER1 rs13078和RAN rs3803012位点不同基因型为自变量,校正其他混杂因素,包括年龄、孕周、收缩压、舒张压和糖尿病史和家族妊娠期高血压疾病史,DICER1 rs13078 T
表5 DICER1 rs13078和RAN rs3803012位点与子痫前期发生风险的Logistic 回归分析
影 响 因 素 基 因 型 β S E Wa l d χ 2 P O R ∗ 9 5 % CI D I C E R 1 r s 1 3 0 7 8 位 点 T T 1 T A 1 . 9 5 6 0 . 6 7 8 2 . 8 8 5 0 . 0 0 5 1 . 7 3 2 1 . 1 4 5 - 2 . 5 2 3 A A 1 . 0 5 8 0 . 6 2 3 1 . 6 9 8 0 . 0 9 2 1 . 0 3 9 0 . 9 8 3 - 1 . 5 1 4 R A N r s 3 8 0 3 0 1 2 位 点 A A 1 A G 1 . 2 7 1 0 . 7 0 2 1 . 8 1 1 0 . 0 7 2 1 . 0 4 7 0 . 5 9 3 - 1 . 1 4 6 G G 1 . 3 4 3 0 . 6 9 5 1 . 9 3 2 0 . 0 5 5 1 . 1 9 6 0 . 9 4 1 - 1 . 5 0 7
*校正变量有年龄、孕周、收缩压、舒张压和糖尿病史和家族妊娠期高血压疾病史
表6 DICER1 rs13078和RAN rs3803012位点与妊娠期高血压发生风险的Logistic 回归分析
影 响 因 素 基 因 型 β S E Wa l d χ 2 P O R ∗ 9 5 % CI D I C E R 1 r s 1 3 0 7 8 位 点 T T 1 T A 1 . 4 6 9 0 . 8 5 9 1 . 7 1 0 0 . 0 8 9 1 . 1 7 2 0 . 5 9 5 - 1 . 2 7 6 A A 1 . 0 7 4 0 . 7 1 2 1 . 5 0 8 0 . 1 3 3 1 . 1 8 1 0 . 8 7 3 - 1 . 5 1 8 R A N r s 3 8 0 3 0 1 2 位 点 A A 1 A G 1 . 3 4 6 0 . 4 1 9 3 . 2 1 2 0 . 0 0 2 2 . 0 1 6 1 . 3 4 2 - 3 . 4 9 5 G G 1 . 1 7 8 0 . 6 4 7 1 . 8 2 1 0 . 0 7 0 1 . 0 3 7 0 . 9 1 3 - 1 . 2 6 4
*校正变量有年龄、孕周、收缩压、舒张压和糖尿病史和家族妊娠期高血压疾病史
讨论
妊娠期高血压疾病是一种妊娠期疾病,会导致孕产妇胎盘早剥、产后出血、心脑血管疾病发生以及多种脏器损伤,而且也容易对胎儿和新生儿的生长发育产生一定的影响[7]。妊娠期高血压疾病主要表现为高血压、尿蛋白和水肿,严重的患者会出现昏迷、抽搐或者是死亡,对分娩时机、分娩方式、孕产妇和胎儿产生巨大的影响[8]。随着人类基因组计划的发展,妊娠期高血压疾病相关基因的定位和识别已成为研究热点。许多研究表明,妊娠期高血压疾病病因复杂,是多因素共同作用的结果,有较强的遗传倾向,基因变异可能是其发病的重要因素之一[9]。
近年大量研究发现 miRNAs 的异常表达与妊娠期高血压疾病相关,异常表达的 miRNA作用于靶基因,抑制或促进靶基因的正常功能,参与滋养细胞行为的调节。DICER和RAN 为miRNA生成的主要关键酶,参与miRNA 转录、剪切、加工、转运等过程,DICER和RAN质和量发生改变直接影响成熟 miRNA 水平、结构及功能变化[10]。而且DICER和RAN 基因多态性可能通过影响 miRNA 的生成及成熟。DICER酶属于核糖核酸内切酶-III家族成员,包括DICER 1 和DICER 2 两种基因,进而影响下游很多靶基因的表达[11]。相关研究表明,DICER 1基因在不同种类的恶性肿瘤中均出现异常表达,并且还与卵巢癌的预后相关[12]。DICER的多态性可能改变其生物学功能,并在各种疾病的发展中发挥重要作用。新的研究表明,在人胎盘中敲除DICER1可显著增强细胞滋养层增殖,这是导致子痫前期发生的主要因素[13]。本研究结果发现,DICER1 rs13078位点基因型基因分布在对照组、妊娠期高血压组和子痫前期组中具有明显差异,而且DICER1 rs13078 T
RAN也是 miRNA 生成的主要关键酶[16]。RAN参与脊椎动物卵母细胞的成熟,减少卵细胞染色体异常的概率。RAN 为合成小分子G蛋白,已被证实参与胎盘的功能调节[17]。在妊娠 8～28 周的孕妇血浆中发现了大量的 RAN 蛋白,这支持了RAN 蛋白在妊娠期高血压疾病发展中的作用。相关研究报道,RAN rs14035 T 等位基因和 CT+TT 基因型在结直肠癌和胃癌中均为保护因素,在复发流产患者中得到类似的结论[18]。本研究得到的结果与上述的结论相反,RAN rs3803012位点基因型基因分布在对照组、妊娠期高血压组和子痫前期组中具有显著差异,且RAN rs3803012 A
综上所述,DICER1 rs13078 T 1 杨孜.妊娠期高血压疾病在真实临床世界实践之辨析.中国实用妇科与产科杂志,2019,35:408-416. 2 石晛,邓芯茹,钟小翠,等.妊娠期高血压疾病相关因素分析.重庆医学,2020,49:457-462. 3 管群,林伟芳,葛佩佩.妊娠期高血压疾病发病的危险因素分析.中国妇幼保健,2021,36:884-886. 4 倪丽君.妊娠期高血压疾病对妊娠结局的影响以及相关危险因素分析.中国妇幼健康研究,2021,32:65-69. 5 Huang X,An Y,Li X,et al.Genetic variants in DICER1,DROSHA,RAN,and XPO5 genes and risk of pregnancy-induced hypertension,Pregnancy Hypertension,2019,16:1153-1161. 6 Tsakiridis I,Giouleka S,Arvanitaki A,et al.Gestational hypertension and preeclampsia:An overview of national and international guidelines.Obstet Gynecol Surv,2021,76:613-633. 7 龙青云,包婧,王小丽,等.妊娠高血压综合征患者病情严重程度与免疫、凝血功能的相关性分析.疑难病杂志,2019,18:493-497. 8 沈银,黎萍.妊娠高血压综合征患者肾脏三维超声参数与血管内皮功能的相关分析.医学研究杂志,2019,48:100-103. 9 左金玲,易建平,陈宝丽.妊娠高血压综合征基因遗传学研究进展.中国妇幼保健,2017,26:379-382. 10 符梅,许文明,覃太周,等.miRNA成熟相关基因DICER、DROSHA、RAN基因多态性与不明原因复发流产的相关性研究.四川大学学报(医学版),2017,48:880-885. 11 路旭,孙松,李玉锋,等.Dicer基因的表达与甲状腺乳头状癌的分期及转移的相关性研究.临床和实验医学杂志,2018,17:265-268. 12 Shao Y,Shen Y,Zhao L,et al.Association of microRNA biosynthesis genes XPO5 and RAN polymorphisms with cancer susceptibility:Bayesian hierarchical meta-analysis.J Cancer,2020,11:2181-2191. 13 Chen J,Qin Z,Pan S,et al.Genetic variants in RAN,DICER and HIWI of microRNA biogenesis genes and risk of cervical carcinoma in a Chinese population.Chin J Cancer Res,2013,25:565-571. 14 Takizawa T,Takahashi H,Kyi-Tha-Thu C,et al.DICER1 is present in the syncytiotrophoblast of the human full-term placenta.J Reprod Immunol,2017,16:124-137. 15 张燕,卫玲,刘媛媛,等.妊娠期高血压患者TGF-β1水平及其基因rs1800469 C/T位点多态性分析.中国优生与遗传杂志,2020,28:679-681,744. 16 赵得雄,靳紫薇,李宗英,等.妊娠期高血压患者中miRNA210表达与尿微量白蛋白/肌酐比的相关性研究.中国妇产科临床杂志,2019,20:551-552. 17 赵影庭,龚时鹏,刘玮.妊娠高血压疾病患者胎盘组织中miR-1233和HoxB3的表达水平及临床意义.河北医药,2019,41:338-342. 18 刘红超,夏亚静,姚丽辉,等.妊娠性高血压患者血清miRNA-17,miRNA-181b的水平与血压及妊娠结局关系的研究.中国优生与遗传杂志,2020,37:649-655. 19 Fawzy MS,Alsel B,Toraih EA.Analysis of microRNA processing machinery gene(DROSHA,DICER1,RAN,and XPO5) variants association with end:tage renal disease.J Clin Lab Anal,2020,16:590-601.