不孕不育症在育龄夫妇中的总体发生率约8%～12%[1],目前认为多种因素均可影响生育能力,例如激素水平、免疫功能、心理状况、内/外生殖器异常,或者年龄、肥胖、手术后遗症,以及配子发生的异常等[2]。随着遗传学检测的发展,许多基因突变已明确与不孕不育症相关,其中男性因素导致不育症的比例约占50%左右[3]。常见的原因例如囊性纤维化跨膜传导调节因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR)基因突变、Y染色体基因突变或微缺失,或存在染色体数目或结构异常等[4]。额外小标记染色体(small supernumerary marker chromosome,sSMC)是一类结构异常的染色体,其大小通常小于同一中期染色体核型中的20号染色体,一般仅用传统细胞遗传学不能明确其来源和特征[5]。sSMC发生率在不同人群中有一定差异,在接受产前诊断的胎儿中发生率为 0.075%,在新生儿中的发生率为 0.044%,在发育迟缓的患者中发生率可达0.288%,而不孕症人群中的发生率约为0.125%[5]。约70%的sSMC携带者无明显临床表现异常,但也有报道发现sSMC可能会导致男性生育能力下降,例如sSMC可能导致的精子发生障碍出现少弱精子症(oligoasthenozoospermia,OAT)等[6]。目前国内对于不孕症人群中sSMC的研究较少,本研究对2013年3月～2021年12月在本院生殖助孕门诊就诊的男性sSMC携带病例进行回顾性分析,探讨 sSMC与临床的相关性,帮助男性sSMC携带人群进行生育指导。
对象与方法
一、研究对象
收集2013年3月—2021年12月就诊于广州医科大学附属第三医院生殖助孕门诊的男性患者。在通过传统的染色体核型分析后,出现除46条染色体外携带1条以上sSMC的患者纳入该研究。排除已明确的生殖系统器质性或病理性等其他原因导致生精障碍的患者。收集 15例核型分析结果为46,XY的男性为对照组。
收集患者精液常规检查、性激素等相关临床资料。同时收集配偶的染色体核型及孕产史。按照WHO人类精液检查和处理实验手册(第五版)标准,少精子症的定义为:精子浓度<15 × 106 /mL;无精子症的定义为:连续 3 次不同时间段精液检查并经离心沉淀后均无精子者;弱精子症的定义为:精子的前向运动率< 32%;畸形精子症的定义为:正常形态精子百分率< 4%。该研究由广州医科大学附属第三医院伦理委员会批准。
二、方法
1. 外周血染色体分析:采用肝素抗凝的外周血进行培养,常规方法制备染色体G显带。制备染色体核型后,用蔡司MetaClient系统计数并分析20个分裂相,按照人类细胞遗传学命名国际体制(ISCN 2020)描述核型。
2. Y染色体AZF微缺失检测:采用透景Y染色体微缺失检验试剂盒,对AZFa区的sY84和sY86、AZFb区的sYl27和sYl34、AZFc区的sY254和sY255的STS位点进行检测。
3. aCGH测序技术:应用微阵列比较基因组杂交(array-based comparative genomic hybridization,aCGH)技术探讨sSMC的来源。采用EDTA抗凝的外周血提取DNA,应用Affymetrix Cvtoscan 750K芯片进行测序,通过ChAs软件进行数据分析,参考DGV(http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home)、 DECIPHER(https://www.deciphergenomics.org/search)、 ClinGen(https://clinicalgenome.org/)等数据库进行生物信息学分析和致病性评估。
4. 统计学分析:采用SPSS 26.0软件进行统计分析数据。计量资料以平均数±标准差
或M(P25～P75)表示,符合正态分布采用独立样本t检验;不符合正态分布采用 Mann-Whitney U 检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。
结果
1.患者基本信息与sSMC的携带类型:本院生殖助孕门诊共20 661例男性患者进行染色体核型分析,其中有15例患者检出携带1条以上sSMC,检出率为0.073%。患者最大就诊年龄44岁,最小29岁,平均年龄34.7岁。15例sSMC患者的生长发育情况和一般体格检查无明显异常。其中13例患者核型为47,XY,+mar,1例患者为48,XY,+2mar,1例患者同时携带8号和21号染色体相互易位,为47,XY,t(8;21)(q22;q11.2),+mar(表 1)。11例患者的配偶随访到染色体核型结果,均为46,XX。
2.sSMC与临床效应分析
(1)精液常规检查:15例sSMC携带者中,共有3例(20%)患者精子浓度大于15 × 106 /mL,其中2例为弱畸精子症,该3例患者染色体核型均为47,XY,+mar。共有5例(33%)患者为无精子症,其中4例患者染色体核型为47,XY,+mar,1例为47,XY,t(8;21)(q22;q11.2),+mar。其余7例(47%)患者为少弱畸精子症,包括6例47,XY,+mar和1例48,XY,+2mar(表1)。与对照组相比,sSMC携带者的精子浓度和向前运动率具有统计学差异(P<0.05),提示sSMC携带者出现少弱精子症的比例高于对照组(表2)。
表1 15例男性sSMC患者核型及主要临床表现
病例 编号 就诊 年龄 (岁) 染色体核型 精液检查 浓度 (10 6 / mL) 向前运动率 (%) 畸形率 (%) 性激素 五项∗ AZF 基因 aCGH 配偶核型 生育史 1 41 47,XY,+mar - 正常 46,XX 继发不育,具体不详 2 31 47,XY,+mar 21. 1 22 99 正常 46,XX 未生育 3 26 47,XY,+mar 5. 3 2 99 正常 46,XX 未生育 4 43 47,XY,+mar 6. 2 27 99 正常 存在 46,XX 未生育 5 35 47,XY,+mar 9 29 98 正常 存在 46,XX 妻子曾自然怀孕生 育 1 孩,后多年不孕 6 29 47,XY,+mar - 雌二醇、促卵 泡生成素↑ 存在 正常 46,XX 未生育 7 28 47,XY,+mar 5. 3 19 99 雌二醇↑ 存在 46,XX 未生育 8 33 47,XY,+mar 17. 2 18 99 未生育 9 34 47,XY,+mar - 46,XX 未生育 10 44 47,XY,t(8;21) (q22;q11. 2),+mar - 正常 存在 未生育 11 34 47,XY,+mar 76. 9 55 92 正常 未生育 12 42 47,XY,+mar 2. 6 - - 存在 正常 46,XX 妻子曾自然怀孕生 育 1 孩, 自 然 流 1 次,后多年不孕 13 29 47,XY,+mar - 正常 存在 未生育 14 41 47,XY,+mar 12. 4 15 99 存在 多条 ROH 46,XX 未生育 15 30 48,XY,+2mar 13. 3 19 99 正常 46,XX 未生育
注:*检查项目为:雌二醇、促黄体生成素、促卵泡生成素、睾酮及泌乳素;-:精液检查提示无精子。
表2 sSMC携带者与对照组常规精液参数的比较
组 别 年 龄 ( 岁 ) 浓 度 ( 1 0 6 / m L ) 向 前 运 动 率 ( % ) 畸 形 率 ( % ) s S M C 组 3 4 ( 2 9 ～ 4 1 ) 5 . 3 ( 0 ～ 1 3 . 3 ) 1 9 . 0 ( 1 6 . 5 ～ 2 8 . 0 ) 9 9 . 0 ( 9 8 . 5 ～ 9 9 . 0 ) 对 照 组 3 4 ( 3 1 ～ 4 1 ) 4 8 . 7 ( 3 6 . 9 ～ 6 8 . 8 ) 5 0 . 0 ( 3 9 . 0 ～ 6 2 . 0 ) 9 8 . 0 ( 9 2 . 0 ～ 9 9 . 0 ) P 值 0 . 4 4 1 < 0 . 0 0 1 0 . 0 0 5 0 . 1 3 3
(2)性激素水平分析:9例患者进行了血清性激素五项,即雌二醇、促黄体生成素、促卵泡生成素、睾酮及泌乳素的检测(表 1)。其中7例(78%)患者性激素水平无异常,包括6例47,XY,+mar和1例47,XY,t(8;21)(q22;q11.2),+mar。其余2例患者染色体核型均为47,XY,+mar,其中1例患者雌二醇为360 pmol/L,促卵泡生成素为15.46 u/L;另1例患者雌二醇为278 pmol/L,均大于正常参考值。
(3) Y染色体AZF微缺失检测:8例患者进行了Y染色体AZF微缺失的检测,染色体核型包括7例47,XY,+mar和1例47,XY,t(8;21)(q22;q11.2),+mar。其中3例患者为无精子症,5例患者为少精子症。该8例患者的AZF均未缺失(表1)。
(4)aCGH检测:5例患者进行aCGH检测以进一步明确sSMC的来源和大小,染色体核型包括4例47,XY,+mar和1例48,XY,+2mar(表1)。其中4例患者aCGH检测结果未发现具有明确临床意义的拷贝数缺失或者重复;1例患者在1q32.3q41、2q12.3q13、10q12.31p12.1、12p11.22p11.1、12q11q13.13区域分布存在9.4、5.6、6.6、6.9和16.1Mb的纯合区域(Runs of homozygosity,ROH),累计约为44.8Mb。该ROH区域未发生在明确致病印迹基因所在的染色体,评估为临床意义不明(表1)。
(5)sSMC与生育情况:15例男性患者中12例患者在就诊前均未生育(80%),提示原发不育。其余3例患者为继发不育,患者的妻子在自然怀孕生育后未能再次怀孕,其中1例患者的妻子曾有自然流产史。
讨论
染色体结构和数目异常是导致男性不育症的主要原因之一,其中以性染色体数目异常、常染色体相互易位、Y染色体微缺失等较为常见[7]。虽然sSMC较为少见,且不同研究之间的检出率有一定差异,但既往研究发现sSMC在不孕不育人群中的发生率(0.125%)要高于一般人群(0.043%),且男性不育症患者的sSMC检出率(0.165%)高于女性不孕症患者(0.022%)[8]。国内有研究对东北地区16 294例男性不育患者的外周血染色体核型进行分析,共发现10例患者的核型为47,XY,+mar,sSMC的检出率为0.061%[9]。本研究在我院生殖助孕门诊就诊的20 661例男性患者的外周血染色体核型中发现了15例sSMC(0.073%),检出率与国内研究的结果较接近。
既往研究数据表明,sSMC携带者中约70%为新发突变,约30%为家族遗传[10],提示部分sSMC携带者可以正常生育并遗传给后代。同时国内外的研究结果也普遍认为sSMC的携带者的通常伴有生育障碍。研究报道约78%的sSMC的携带者存在生育缺陷[10]。国内有研究发现在21例sSMC的携带者中19例(90%)表现为生殖障碍,包括11例男性和8例女性。其中男性患者的主要表现为原发性不育、少弱畸精子症以及妻子胚胎停育。而女性患者的主要表现为子宫卵巢未发育、原发性闭经、反复流产以及不孕症[10]。本研究报道的15例男性患者中,12例患者提示原发不育(80%),其余3例患者为继发不育。而男性无精子症患者中约7%与sSMC携带有关[11],提示sSMC直接影响男性精子状况。本研究中的15例患者,除1例精液常规无明显异常外,其余14例(93%)患者均出现不同程度的精液异常。其中以少弱畸精子症(7例,47%)患者最为多见,其次为无精子症(5例,33%),还有2例患者为弱畸精子症。与对照组相比,sSMC携带者的精子浓度和向前运动率具有统计学差异,提示sSMC携带者可能导致少弱精子症。Y染色体无精症因子(AZF)区的微缺失已被证明与生精障碍密切相关[12]。为排除AZF的微缺失导致的精子异常,本研究共8例患者(3例无精子症,5例少精子症)进行AZF区的检测并发现均未缺失,提示sSMC患者的精液异常可能与sSMC携带直接相关。
sSMC导致男性患者出现生育障碍的原因,一般认为sSMC男性携带者在减数分裂过程中常出现染色体的异常配对和分离可能会产生染色体数目或结构异常的不平衡配子,进而影响精子正常发生和运动的过程[8]。研究表明与正常对照相比,sSMC可导致的精子非整倍体发生率显著增加[5]。其次,sSMC可能影响染色体的空间定位,干扰或阻止配子的减数分裂[13]。此外,少弱畸精子症多见于来源于近端着丝粒染色体的sSMC 携带者,其中又以15号染色体来源最常见[5,10]。一方面来源于15号染色体的sSMC可能携带部分基因,使拷贝数增加产生剂量效应,降低了染色体的正确配对能力,造成男性生精障碍[14]。同时根据15号sSMC所含片段大小及是否涉及Angleman和Prader-Willi综合征关键基因,其携带者还可能伴有发育迟缓、智力障碍、肌张力减退等其他临床表现[10]。在本研究中,5例患者通过aCGH检测均未发现15号或其他染色体片段的拷贝数增加,提示sSMC可能来源于aCGH探针未涉及的区域,例如异染色质区等。由于本研究的患者未进行其他分子细胞遗传学检测,例如荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)等,暂不能排除是否有来源于15号近端着丝粒染色体的可能。1例患者检测出多条ROH,因未进行父母验证未排除是否存在单亲二倍体(uniparental disomy,UPD)的可能。UPD合并sSMC较少见,可能与早期胚胎发生中染色体调控机制有关。Liehr等汇总了已报道的46例sSMC合并UPD的病例,发现UPD常见于6、7、14、15、16和20号染色体,且母源性UPD的发生率约是父源性的9倍[15]。同时该研究也提示合并UPD的患者无论其sSMC的染色体来源如何,均可能主要与UPD有关[15]。此外携带sSMC的患者出现生育障碍的临床表现存在一定差异,研究报道sSMC来源相同的患者临床症状也可能不一致[13]。因此sSMC导致精子异常的原理和机制目前尚未完全阐明,仍待进一步的研究和探索。本研究中其余患者未进行aCGH或其他分子细胞学检测,sSMC的来源不能完全明确,在今后的研究中应结合多项检测对患者的sSMC来源进行更精准的诊断。
对于sSMC导致不孕不育同时有生育需求的夫妇,辅助生殖技术可以为sSMC患者提供帮助。孙美玲等报道了一例携带sSMC的男性不育症患者,经卵胞浆内单精子显微注射技术其妻子成功怀孕并生育正常后代[16]。此外植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis,PGD) 可以对sSMC携带者植入前胚胎中的sSMC以及胚胎中的非整倍体进行检测。目前关于sSMC与PGD应用的报道相对较少。Oracova等报道了一例携带15号染色体来源的sSMC原发性不育男性,PGD分析提示正常染色体胚胎的比例约为40%[17]。
综上所述,sSMC作为一类较罕见的染色体异常,是否导致临床表型改变主要与sSMC的来源、是否涉及致病基因、是否为UPD、有无嵌合等相关。其中生育障碍是sSMC携带者较为常见的表型,其机制可能与sSMC干扰减数分裂过程导致精子发生异常以及UPD等有关。目前染色体核型分析仍是诊断sSMC的首选方法,同时可以结合分子遗传学检测,例如aCGH,FISH等为患者提供更精确的诊断和遗传咨询。对有生育需求的患者,需综合评估sSMC的来源、临床表型等,适当采用辅助生殖技术,提高正常生育率。
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