乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,占全部女性恶性肿瘤18%,病死率居女性恶性肿瘤第二位[1]。40岁以后,乳腺癌的发病率明显上升,70岁以后发病率可见拐点。目前,国内乳腺癌相关筛查和诊疗指南中多以40岁作为乳腺癌独立的危险因素和筛查起始年龄[2]。三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)患者预后比较差,在诊断后3～5年出现早期复发高峰,其发病率是15%～20%,病死率占1/3[3]。免疫系统能够监视肿瘤的发生,且可以通过细胞免疫机制来消除肿瘤,当机体的免疫监视功能低下时,肿瘤的发生风险增加[4]。现有文献表明,机体免疫系统在正常情况下是可以针对机体肿瘤抗原产生特异性免疫反应,但大多数肿瘤并没有随着免疫反应的发生而消亡,说明机体的某种机制诱导人体丧失产生有效抗肿瘤免疫应答的能力。CD4+、CD25+调节性T细胞在维持免自身免疫耐受、调节适应性中发挥重要作用,可抑制多种免疫细胞(CD4+ CD25-T 细胞、NK 细胞、树突状细胞和单核细胞等,防止自身免疫现象的发生[5].有鉴与此,本文探讨了乳腺肿瘤患者外周血中调节性T细胞和 T 淋巴细胞亚群分布情况及其临床价值。
对象与方法
1.研究对象:收集2019.5—2021.11本院收治的均经临床病理检查确诊的女性乳腺癌患者120例,患者年龄范围25～72岁,平均(50.3± 11.3)岁; 左右侧各58、62例;同侧腋窝淋巴结转移者和无转移者各80例和40例。纳入标准:(1)临床病理检查确诊女性乳腺癌;(2)无其他肿瘤、急性或慢性炎症、血液系统疾病及自身免疫性疾病;(3)采血前未做任何化疗及放疗。排除标准:(1)妊娠或哺乳期;(2)严重肺部感染或全身感染;发热、炎性疾病、类风湿疾病; (3)入院前肿块切除活检;(4)化疗药物过敏; (5)免疫系统疾病或免疫抑制使用。
按照《新编常见恶性肿瘤诊治规范》中TNM分期标准进行分类,其中Ⅰ期-Ⅳ期患者各25、45、38、12例。乳腺癌患者120例均未经放疗或化疗。选择46 例 20-65岁内,平均(49.2±12.0)岁的健康女性作为对照组,分析前比较了2组受试者年龄差异无统计学意义(P>0.05)。两组受试者均无免疫系统疾病或使用过免疫抑制剂。患者的一般资料基本一致。根据2021年出版的《中国抗癌协会乳腺癌诊治指南与规范》文件,本研究患者体内分子的分型结合ER,PR,HER2,Ki-67表达情况分为:Luminal A 型、Luminal B 型、HER2 过表达、三阴型(ER、PR、HER2 三种受体均阴性)四组。目前乳腺癌的分子分型的标志物检测和判定方法详见表1[6]。
表1 乳腺癌分子分型的标志物检测和判定方法[6]
内在分子分型基于IHC4的分子分型备注Luminal A型Luminal A样ER/PR阳性且PR高表达HER2阴性Ki-67增殖指数低Ki-67增殖指数的判定值在不同病理实验中心可能不同,可采用20%-30%作为判断Ki-67增殖指数高低的界值;同时,以20%作为PR表达高低的判定界值∗,可进一步区分Luminal A样和Luminal B样(HER2阴性)Luminal B型Luminal B样(HER2阴性)ER/PR阳性HER2阴性且Ki-67增殖指数高或PR低表达上述不满足Luminal A样条件的Luminal样肿瘤均可作为Luminal B样亚型ERBB2+型HER2阳性HER2阳性(蛋白过表达或基因扩增) ER阴性和PR阴性Basal-like型三阴性(非特殊型浸润性导管癌)ER阴性PR阴性HER2阴性三阴性乳腺癌和Basal-like型乳腺癌之间的吻合度约80%;但是三阴性乳腺癌也包含一些特殊类型乳腺癌如化生性癌和腺样囊性癌。
*:以20%作为PR表达高低的判定界值,目前仅有1篇回顾性文献支持(J Clin Oncol,2013,31:203-209)
本研究经南京市妇幼保健院医学伦理委员会批准(伦理批号为:[2019]LSKY025),所有参与者均提供知情同意。
2.仪器与方法
(1)外周血中调节性T细胞
对标本按照SOP标准进行编号,然后在Limsbox系统中进行分析前确认;充分混匀抗凝全血,用反向加样法吸取50 ul全血加至流式管底部(注意全血不要碰到管壁);分别吸取CD4抗体(8ul)、CD25抗体(8ul)、CD127抗体(2 ul)加至全血中,涡旋混匀5 s;室温避光孵育15～20 min,悬空加入450 uL预稀释1×FACSlysing solution,涡旋混匀5 s;室温避光孵育10～15 min,悬空加入2 mL生理盐水或PBS,放入离心机300 g离心5分钟。弃上清,涡旋混匀5 s,加入300 ul生理盐水或PBS重悬细胞,上机前充分混匀,选用FACSDiva科研软件,选择Treg分析模板。美国 BD公司FACsCanto流式细胞仪。
(2)T淋巴细胞亚群
取经肝素抗凝的100 μl外周血,加入20 μl单抗混匀后将其置于室温避光染色20 min,然后加入红细胞裂解液1.5 mL混匀,室温下避光放置10 min,1500 r/min离心5 min,弃去上清液后每管内加入2 mL 0.1%叠氮钠的磷酸盐缓冲液,1000 r/min 离心5 min,弃去上清加入1 mL PBS,混匀后2 h内上机检测[7]。美国 BD公司FACsCanto流式细胞仪。单克隆抗体FITC 标记兔抗人 CD3抗体、PE 标记兔抗人CD4抗体、PE标记兔抗人 CD8抗体、PE标记兔抗人NK 蛋白受体均购于美国 BD公司。红细胞裂解液购于美国 BD公司[7]。CD3+T百分含量参考值为:61.1%～77%;CD4+ T百分含量参考值为:25.8%～41.6%;CD8+ T百分含量参考值为:18.1%～29.66%;CD4+T/CD8+T细胞比值为:0.98～1.94.
3.统计学处理:采用SPSS19.0 统计学软件进行数据分析。计量资料符合正态分布,以均数±标准差表示,两组组间比较采用独立样本t检验,组内比较采用配对样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析(F),P<0.05 有统计学意义。
结果
1.乳腺癌患者与对照组细胞免疫功能比较:乳腺癌患者CD8+ 细胞水平显著升高(P<0.05)外,其余指标和对照组相比显著降低。乳腺癌组患者 Treg 细胞比例与对照组相比均有统计学差异(P<0.05),见表2。
表2 乳腺癌患者与对照组细胞免疫功能比较
分组nCD4+CD25+ CD127lowTregCD3+(%)CD4+(%)CD8+(%)CD4+/CD8+NK(%)对照组460.6±0.166.8±5.740.7±4.425.2±3.91.6±0.220.1±3.6乳腺癌组1201.5±0.3∗60.5±4.2∗32.7±4.6∗28.2±3.5∗1.3±0.2∗15.1±2.5∗
注:*与对照组相比,P<0.05
2.不同分期乳腺癌患者细胞免疫功能比较:不同分期乳腺癌患者细胞免疫功能差异有统计学意义(P<0.05),随着临床分期的升高,除了CD8+ 细胞水平逐渐升高,其余指标细胞水平逐渐降低(P<0.05),各期乳腺癌患者外周血中 Treg 细胞比例随临床分期的进展呈上升趋势,其中Ⅰ-Ⅳ期乳腺癌患者 Treg 细胞比例与对照组相比均有统计学差异(P<0.05),Ⅲ、Ⅳ期与Ⅰ期患者相比、Ⅳ期与Ⅱ期患者相比 Treg 细胞比例显著性升高(P<0.05),见表3。
表3 不同分期乳腺癌患者细胞免疫功能比较
TNMnCD4+CD25+ CD127lowTreg∗CD3+(%)∗CD4+(%)∗CD8+(%)∗CD4+/CD8+∗NK(%)∗I250.9±0.265.4±6.235.2±5.825.4±3.61.6±0.318.3±2.7II451.2±0.261.8±5.032.7±5.627.8±2.91.3±0.316.7±2.9Ⅲ381.9±0.458.5±4.929.9±3.332.5±3.31.2±0.213.5±2.9IV122.1±0.555.2±3.928.5±3.535.3±3.00.8±0.210.3±1.9
注:*各组比较,P<0.05
3.有无淋巴转移乳腺癌患者细胞免疫功能比较:有淋巴结转移乳腺癌患者除了CD8+细胞水平较无淋巴结转移患者显著升高(P<0.05)外,其余指标显著减低,有淋巴结转移的乳腺癌患者外周血 Treg 细胞的比例相对于无淋巴结转移者明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)见图1。
图1 有无淋巴结转移乳腺癌患者细胞免疫功能比较
4.分子分型的四组患者外周血 T 淋巴细胞亚群的数量比较:下表中三阴型组 CD3+和 CD4+指标高于其余三组,CD8+和CD4+/CD8+指标明显低于其余三组,差异具有统计学意义(P<0.05)。NK%各组差异无统计学意义( P>0.05),见表4。
表4 四组患者外周血 T 淋巴细胞亚群的数量比较
分组nCD3+(%)CD4+(%)CD8+(%)CD4+/CD8+NK(%)Luminal A2263.2±5.930.3±5.223.6±2.91.8±0.315.3±2.7Luminal B4353.8±4.725.2±3.535.1±3.81.5±0.214.7±2.9HER2过表达组2060.7±5.228.6±3.631.6±3.21.6±0.314.2±1.9三阴型组3569.3±6.2∗38.2±5.7∗18.8±2.6∗1.3±0.2∗15.0±2.3
注:*与其他各组比较,P<0.05
讨论
淋巴细胞(包括T细胞,Treg细胞和NK细胞)与乳腺癌的初级预防与病情程度的评估紧密关联,由T淋巴细胞介导的细胞免疫应答在抗肿瘤免疫中有着至关重要的位置和意义[8]。分类上根据表型以及功能不同分为CD4+T 及CD8+T 细胞二类(抗人体免疫应答的主要效应细胞)[9,10]。而当CD4+、CD8+T 细胞平衡状态失衡时就会削弱机体抵御肿瘤的能力,细胞免疫功能进一步降低[11]。NK免疫细胞的特点是具有先天免疫和适应性免疫特性,在肿瘤免疫监视过程中发挥抑癌功能[12-13]。
研究发现NK细胞受损与乳腺肿瘤分期进展有关联[14]。因此,NK细胞的检测对于该肿瘤的后期的临床诊治、情况改善预测具有重要的指导方向性[15]。本实验数据初步探讨了乳腺肿瘤患者外周血 CD3+、CD4+、CD4+/CD8+以及 NK 细胞水平明显低于健康人群,而 CD8+ 则相反,提示该疾病中机体免疫功能受到明显抑制。有文献显示,肿瘤患者组织检测到致使该肿瘤免疫能力出现损伤的免疫抑制因子[16]。同时,本研究也进一步分析数据显示,乳腺肿瘤患者分期程度越高其前述提及的免疫指标结果越低,研究结果与近期2021年Stenström J和2022年刘刚报道相一致[7,17]。阐明肿瘤负荷越大,其分泌免疫抑制因子越多,自然抑制了T 细胞的正常分化以及增殖,免疫逃逸反应程度加大。而对于出现淋巴结转移的乳腺癌患者,其细胞免疫功能更低,预后往往不佳。可能是肿瘤免疫逃逸的重要机制和目前肿瘤免疫治疗难有效的原因之一的Treg 细胞介导的免疫抑制。本次乳腺癌组120例患者中的 Treg 细胞(外周血)存在上调现象。同时,该研究结果表明外周血中的Treg 细胞随着分期的加深呈阶梯状上升。Ⅲ期和IV 期者外周血Treg 细胞高于前两期,与2023年Usman AN报道基本一致[18]。同时,有淋巴结转移的乳腺癌患者外周血 Treg 细胞的比例相对于无淋巴结转移者显著升高,进一步说明 Treg 细胞比例对评估乳腺癌预后具有指导性参考。
同时,根据受体的表达程度不同,将原发性乳腺癌分为四组(Luminal A,Luminal B,HER2过表达,三阴型组)[19]。肿瘤浸润淋巴细胞在乳腺癌肿瘤的免疫应答和调控机制等阶段中起到较明显重要的作用。早期识别不同分子类型的肿瘤微环境有助于乳腺癌的早期诊断。本次研究结果显示三阴型组 CD3+和 CD4+指标高于其余三组,CD8+和CD4+/CD8+指标明显低于其余三组,差异具有统计学意义,本次研究根据表4结果,说明不同程度的乳腺癌患者体内的不同分子分型中所包含的 T 淋巴细胞在表达方面也有巨大差异,这是肿瘤组织微环境的差异导致的,而这差异一步一步影响了疾病的发展状况[20],所以不同分子分型的乳腺癌患者病情发展过程中病情变化状况与疾病特点是不完全一样的,这种不同分子分型的乳腺癌患者中的肿瘤组织微环境的不同会影响疾病的进程方向[21]。
综上所述,监测患者上述所表述指标(CD4+/CD8+ T细胞、Treg 细胞等)和研究不同分子分型的原发性乳腺癌体内 T 淋巴细胞的表达状况,对判断乳腺癌患者病情发展(如肿瘤进展、淋巴结转移)治疗预后有着一定的参考价值。本研究不足之处是样本量相对偏小,后期尚需更大样本量和更全面的深入研究。
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