复发性妊娠丢失(recurrent pregnancy loss,RPL)定义为妊娠24周前两次或两次以上的自然流产[1]。而在国内临床实践中,常以两次或两次以上妊娠28周前的自然流产作为启动干预的标准。RPL的发病率为1%～5%[2,3]。RPL的病因包括自身免疫异常、血栓前状态、女性生殖道解剖结构异常、内分泌功能异常、夫妻染色体异常、胚胎染色体或基因异常等[3]。还有近50%的RPL患者病因不明,称为不明原因复发性妊娠丢失(unexplained RPL,URPL)[4]。近年来,随着母胎界面免疫细胞的组成逐渐被阐明,免疫因素成为URPL的研究热点之一。母胎界面含有蜕膜自然杀伤(decidual natural killer,d-NK)细胞、巨噬细胞、T细胞等一系列免疫细胞,母胎界面免疫细胞的失衡或功能改变可能导致包括RPL在内的一系列病理妊娠[5]。女性上生殖道微生物的存在及其与某些妇科疾病的关联性[6]打破了人类胎儿发育环境是无菌的传统观点,也为URPL的病因研究提供了一种全新的可能性。NK细胞是淋巴细胞的一个亚群,在肿瘤和病毒感染的先天和适应性免疫反应中起重要作用[7]。目前的观点认为,NK细胞除了免疫防御功能之外,还能够维持免疫稳态,而免疫稳态在妊娠过程中至关重要。因此,NK细胞在URPL发病中的作用成为研究热点。本文将综述NK细胞的亚群及其在URPL发病中可能的作用机制。
一、NK细胞亚群
NK细胞的常用定义是CD3-CD56+或CD3-CD16+,既是先天免疫系统的重要组成部分[8],还能通过杀死树突状细胞、细胞毒性T细胞等几种激活的免疫细胞来维持免疫稳态[9,10],在免疫调节中发挥重要作用。而胚胎作为一种半异体移植物,在母体免疫系统过度激活的情况下可能受到伤害。因此,NK细胞维持免疫稳态的功能在正常妊娠的维持中意义重大。
1.NK细胞的传统分类方法
NK细胞由不同亚群组成,各亚群的功能趋于专业化。根据存在的位置,NK细胞可以分为外周血NK(peripheral Natural Killer,p-NK)细胞和组织驻留NK(tissue-resident Natural Killer,tr-NK)细胞。在外周血中,NK细胞占淋巴细胞的5%-15%,其中5%表达高水平的CD56,称为CD56bright NK细胞,另外95%为CD56dim NK细胞[11]。
除p-NK细胞之外,还有tr-NK细胞存在于非经典的免疫器官中,其内部具有高度的异质性[12]。子宫NK(uterine natural killer,u-NK)细胞是女性生殖道中的重要免疫细胞[13]。u-NK细胞在妊娠过程中转变为蜕膜NK(decidual natural killer,d-NK)细胞,二者在正常妊娠的维持和异常妊娠的发生中均发挥重要作用。比较研究显示,早期人类妊娠标本中的大颗粒淋巴细胞的CD56表达远高于外周血CD56bright NK细胞;此外,子宫tr-NK细胞表达CD49a,且已有研究证明子宫CD49a+细胞与胎儿发育和RPL的发病有关[14,15]。
2.基于T淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白3的NK细胞分类方法
除了传统的分类方法之外,也有研究提出更具有临床意义的分类方法。T淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白3(T-cell immunoglobulin domain and mucin domain-containing molecule-3,Tim-3)是一种存在于多种淋巴细胞表面的受体分子,在部分d-NK细胞和p-NK细胞中表达,在抗感染和抗肿瘤免疫中发挥重要作用。Tim-3+ p-NK细胞约占p-NK细胞的90%,而Tim-3+ d-NK细胞在d-NK细胞中占60%左右[16]。
与Tim-3-d-NK细胞相比,Tim-3+ d-NK细胞分泌更多的Th2型细胞因子IL-4和更少的Th1型细胞因子TNF-α以及穿孔素[16]。在人类流产和小鼠流产倾向模型中,Tim-3+ d-NK细胞的百分比下降,Th2型细胞因子减少,Th1型细胞因子增加[17]。这提示Tim-3介导的d-NK细胞的免疫活性降低可能是维持母体免疫耐受的机制之一。与d-NK细胞相似,RPL患者p-NK细胞Tim-3丰度降低,Tim-3+ p-NK细胞免疫抑制活性受损,进一步研究显示,外源Tim-3+ p-NK细胞能够减少流产倾向和NK细胞缺陷小鼠的胎儿损失[18]。
总之,以Tim-3为标志对p-NK细胞和d-NK细胞进行进一步的分型在RPL的临床实践中可能具有更大的意义。无论是外周血中还是蜕膜中,Tim-3+ NK细胞都被看作是RPL诊断的潜在生物标记物[17,18]。
3.u-NK细胞与d-NK细胞的特性
u-NK细胞的主要表型是CD3-CD56brightCD16-,区别于外周血中常见的CD3-CD56dimCD16+ NK细胞[19],可能是外周血CD56bright NK细胞进入子宫并进行组织特异性分化的结果。在人胎盘建立时,存在于母体蜕膜的白细胞70%以上是CD3-CD16-CD56+ NK细胞[20]。在妊娠过程中,女性生殖道中的NK细胞几乎全部存在于蜕膜组织中,称为d-NK细胞。
与p-NK细胞相比,d-NK细胞能够有效地产生细胞因子,但细胞毒性较差。这可能是由于d-NK虽然能与靶细胞结合,但不能有效形成免疫突触并将含有穿孔素的颗粒极化到靶细胞接触位点[21]。此外,d-NK细胞的细胞毒性受多种细胞因子的调节[18]。新的研究发现,d-NK细胞可以通过细胞间纳米管在不杀死被感染细胞的前提下杀死细胞内感染的细菌[22],这可能解释了为什么细胞毒性较差的d-NK细胞能够在妊娠过程中起到抗感染作用。
二、NK细胞在妊娠中的作用
NK细胞在正常妊娠的维持中发挥重要作用。一方面,NK细胞作为一种免疫细胞,在妊娠抗感染免疫中发挥作用,同时维持母胎界面的免疫平衡;另一方面,NK细胞参与滋养层侵袭和子宫动脉重塑的调节,从而维持正常妊娠。
1.NK细胞在妊娠抗感染免疫中的作用
病原体引起的炎症反应理论上都可能导致流产,但多为散发性[23],如细菌性阴道病是流产的高危因素之一[24]。但是,感染也是RPL发病的重要因素。除细菌性阴道病外,RPL患者中检出率较高的病原体还包括支原体、弓形虫等[25]。
NK细胞是女性生殖道中主要的淋巴细胞,在妊娠抗感染免疫中发挥重要作用。革兰氏阴性菌脂多糖可诱发未成熟的u-NK细胞过量进入妊娠小鼠子宫,说明u-NK细胞与妊娠期感染诱发的保护性炎症反应有关[26]。一项在243名RPL患者中进行的研究表明,p-NK细胞升高的RPL患者更有可能受到阴道加德纳菌和革兰氏阴性菌的定植,这可能表明阴道微生物群、局部炎症、免疫参数变化和流产之间存在关联[27]。也有研究表明,p-NK细胞与d-NK细胞的数量之间存在相关性[28],这进一步说明在感染存在时,d-NK细胞可能作为抗感染免疫的增强因素发挥重要的作用。此外,u-NK细胞对HCMV、刚地弓形虫、HCV、单核细胞增生李斯特菌均能产生免疫反应[29]。
d-NK细胞参与妊娠免疫反应的机理尚不明确。有研究发现,d-NK细胞能够在体外强烈抑制HIV感染,而IFN-γ在这一过程中发挥重要作用[30]。这提示d-NK细胞参与抗感染的机制可能不是直接接触,而是通过某些细胞因子发挥作用。d-NK细胞在免疫突触形成上的缺乏可以佐证这一观点[21]。新的研究揭示,d-NK细胞可以通过纳米管在不杀死被感染细胞的情况下杀死细胞内的细菌[22],这为d-NK细胞的抗感染机制提供了新的思路。
上述研究表明,d-NK细胞在妊娠期间的抗感染免疫中发挥积极作用。但是,正如前文所述,NK细胞除了免疫防御之外,还参与免疫平衡的维持。因此,感染导致的d-NK细胞激活除诱发炎症反应[26]之外,还有可能引发母体免疫系统的过度激活,导致胎儿损伤乃至流产。
2.NK细胞在滋养层侵袭与子宫动脉重塑中的作用
除了抗感染之外,有研究表明,d-NK细胞在滋养层侵袭与子宫动脉重塑中作用明显。首先,d-NK细胞的数量的变化趋势表明d-NK细胞更可能与早孕期的生理过程相关。d-NK细胞聚集在子宫螺旋动脉周围,靠近绒毛外滋养层细胞(extravillous trophoblast,EVT)[31],提示它们在调节滋养层侵袭和血管重塑中的潜在作用。有研究在体外观察到d-NK细胞通过分泌IL-8和 IP-10分别作用于滋养层细胞表面的CXCR1和CXCR3来诱导滋养层迁移;来自d-NK细胞的上清液诱导人脐血管内皮细胞(HUVEC)迁移,而这种血管生成特性被中和VEGF和PLGF因子的Flt1-Fc融合蛋白抑制[32]。这项研究在体外充分证明了d-NK细胞在滋养层侵袭和血管重塑中的作用,并提出了其可能机制。
NK细胞参与滋养层侵袭和子宫动脉重塑的机制比较复杂。d-NK细胞分泌的IL-8和IP-10可能在体外支持滋养层侵袭的过程中起到重要作用[33]。而在血管重塑方面,d-NK细胞分泌的IFN-γ通过促进母系表达基因3(maternally expressed gene 3,MEG3)、p53和基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP-2)的表达抑制VSMC增殖、刺激VSMC迁移、诱导VSMC凋亡,从而影响子宫动脉重塑[34]。除此之外,d-NK细胞能够产生多种细胞因子和血管生成因子[31],也可能不同程度影响早期胚胎发育。
有研究认为,CCL3、CCL4和CXCL12等趋化因子是d-NK细胞潜在的化学诱导剂[35],这些趋化因子水平的改变可能导致蜕膜中d-NK细胞水平的改变,进而影响滋养层侵袭与子宫动脉重塑。EVT表面的HLA-G能够抑制NK细胞对EVT的细胞毒性,而敲除HLA-G的细胞则受到NK细胞的攻击,这种效应被认为是HLA-G作用于d-NK细胞表面的KIR2DL4或ILT2或同时作用导致的[36,37]。d-NK细胞表面的KIR2DL4也可以对可溶性HLA-G产生作用。HLA-G作用于d-NK细胞可以抑制d-NK细胞的增殖、细胞毒性和趋化性,诱导IL-10等保护因子的分泌[38]。这一系列研究均表明,EVT表面的和可溶性的HLA-G可能在d-NK细胞调控滋养层侵袭和子宫动脉重塑的过程中发挥关键的调控作用。此外,EVT上的HLA-E和d-NK细胞上的CD94/NKG2A之间的相互作用也被认为可以抑制d-NK细胞对滋养层细胞的杀伤,进而降低RPL、先兆子痫等的发病风险[39]。
三、NK细胞与URPL
NK细胞在抗感染免疫、滋养层侵袭、子宫动脉重塑等重要的妊娠过程中均发挥重要作用,但其与URPL的关系仍不明确。
有研究从统计学角度阐释了NK细胞与RPL的关系。在分泌中期进行的子宫内膜活检显示,RPL患者子宫内膜CD56+ u-NK细胞计数明显高于对照组,且CD16+CD56dim u-NK细胞比例较高,而CD16-CD56bright u-NK细胞比例较低。这一发现可能具有重要的功能意义,因为CD16+ NK细胞比CD16-NK细胞具有更强的细胞毒性,并参与抗体依赖的细胞毒作用[40]。一项在160名有RPL史的非怀孕妇女中进行的前瞻性研究发现再次妊娠以正常染色体核型流产的妇女的p-NK细胞活性高于活产妇女,p-NK细胞活性≥33%的女性发生正常染色体核型流产的风险较高(RR=3.4,95%CI=1.3～8.7)[41]。这些研究表明,NK细胞相关的免疫因素可能是RPL发病的重要原因。
NK细胞参与RPL发病的机制可能包括影响滋养层侵袭和子宫动脉重塑。与对照组相比,RPL患者的子宫内膜血管含量更高,螺旋动脉壁更厚;RPL患者螺旋动脉完全被表达平滑肌肌球蛋白的血管平滑肌细胞包围[40],提示RPL的发病可能与子宫动脉重塑有关。RPL患者蜕膜组织中IL-8、IP-10水平高于对照组,而VEGF水平低于对照组;RPL患者CD56+CD94+d-NK细胞培养上清液显著降低人脐静脉内皮细胞的血管生成能力[42],进一步提示d-NK细胞参与了与子宫动脉重塑异常相关的RPL发病。此外,RPL患者d-NK细胞KIR2DL4和NKG2A的表达在百分比和平均荧光强度方面都低于对照组[42],而这两种受体恰好是前文所述的抑制d-NK细胞对EVT的细胞毒性的HLA分子的目标受体,提示NK细胞的HLA受体的改变可能导致其对EVT的细胞毒性增强,最终引起RPL的发病。
虽然许多研究表明NK细胞的异常与RPL的发病有关,但NK细胞异常的原因还不明确,因此此类RPL仍属于URPL,也没有针对性的治疗方法。d-NK细胞虽然参与调节多种妊娠生理过程,但其本质上仍然是一种免疫细胞。感染、炎症、菌群失调等异常状态对d-NK细胞的影响可能是下一步研究的重点方向。
u-NK细胞和d-NK细胞是tr-NK细胞在女性生殖道中的亚群在不同生理阶段的两种表现形式。它们既参与女性月经周期和妊娠免疫反应,又在妊娠早期的滋养层侵袭和子宫动脉重塑过程中发挥调节作用。病理状态下,d-NK细胞的过强细胞毒性状态和对子宫动脉重塑的异常调控可能是一部分URPL的发病的重要因素,但导致d-NK细胞异常的因素目前仍不明确。在接下来的研究中,感染、内分泌、生殖道菌群等如何影响d-NK细胞的功能进而影响妊娠将成为研究的重点。
1 Bender Atik R,Christiansen OB,Elson J,et al.ESHRE guideline:recurrent pregnancy loss:an update in 2022.Hum Reprod Open,2023,2023:hoad002.
2 Tise CG,Byers HM.Genetics of recurrent pregnancy loss:a review.Curr Opin Obstet Gynecol,2021,33:106-111.
3 Dimitriadis E,Menkhorst E,Saito S,et al.Recurrent pregnancy loss.Nat Rev Dis Primers,2020,6:98.
4 Yu N,Kwak-Kim J,Bao S.Unexplained recurrent pregnancy loss:Novel causes and advanced treatment.J Reprod Immunol,2023,155:103785.
5 Yang F,Zheng Q,Jin L.Dynamic function and composition changes of immune cells during normal and pathological pregnancy at the maternal-fetal interface.Front Immunol,2019,10:2317.
6 Chen C,Song X,Wei W,et al.The microbiota continuum along the female reproductive tract and its relation to uterine-related diseases.Nat Commun,2017,8:875.
7 O′Brien KL,Finlay DK.Immunometabolism and natural killer cell responses.Nat Rev Immunol,2019,19:282-290.
8 Guerrero B,Hassouneh F,Delgado E,et al.Natural killer cells in recurrent miscarriage:An overview.J Reprod Immunol,2020,142:103209.
9 Zitti B,Bryceson YT.Natural killer cells in inflammation and autoimmunity.Cytokine Growth Factor Rev,2018,42:37-46.
10 Mora-Bitria L,Asquith B.Innate receptors modulating adaptive T cell responses:KIR-HLA interactions and T cell-mediated control of chronic viral infections.Immunogenetics,2023,75:269-282.
11 Wang F,Tian Z,Wei H.Genomic expression profiling of NK cells in health and disease.Eur J Immunol,2015,45:661-678.
12 Peng H,Tian Z.Diversity of tissue-resident NK cells.Semin Immunol,2017,31:3-10.
13 Sfakianoudis K,Rapani A,Grigoriadis S,et al.The Role of uterine natural killer cells on recurrent miscarriage and recurrent implantation failure:from pathophysiology to treatment.Biomedicines,2021,9:1425.
14 Fu B,Zhou Y,Ni X,et al.Natural Killer Cells Promote Fetal Development through the Secretion of Growth-Promoting Factors.Immunity,2017,47:1100-1113.e6.
15 Tong X,Gao M,Du X,et al.Analysis of uterine CD49a(+) NK cell subsets in menstrual blood reflects endometrial status and association with recurrent spontaneous abortion.Cell Mol Immunol,2021,18:1838-1840.
16 Li Y,Li D,Du M.TIM-3:a crucial regulator of NK cells in pregnancy.Cell Mol Immunol,2017,14:948-950.
17 Li YH,Zhou WH,Tao Y,et al.The Galectin-9/Tim-3 pathway is involved in the regulation of NK cell function at the maternal-fetal interface in early pregnancy.Cell Mol Immunol,2016,13:73-81.
18 Li Y,Zhang J,Zhang D,et al.Tim-3 signaling in peripheral NK cells promotes maternal-fetal immune tolerance and alleviates pregnancy loss.Sci Signal,2017,10:eaah4323.
19 Xu X,Zhou Y,Fu B,et al.Uterine NK cell functions at maternal-fetal interface†.Biol Reprod,2022,107:327-338.
20 Rao VA,Kurian NK,Rao KA.Cytokines,NK cells and regulatory T cell functions in normal pregnancy and reproductive failures.Am J Reprod Immunol,2023,89:e13667.
21 Kopcow HD,Allan DS,Chen X,et al.Human decidual NK cells form immature activating synapses and are not cytotoxic.Proc Natl Acad Sci U S A,2005,102:15563-15568.
22 Crespo 
C,Mulik S,Dotiwala F,et al.Decidual NK cells transfer granulysin to selectively kill bacteria in trophoblasts.Cell,2020,182:1125-39.e18.
23 La X,Wang W,Zhang M,et al.Definition and Multiple Factors of Recurrent Spontaneous Abortion.Adv Exp Med Biol,2021,1300:231-257.
24 Tavo V.Prevalence of Mycoplasma hominis and Ureaplazma urealyticum among women of reproductive age in Albania.Med Arch,2013,67:25-26.
25 Giakoumelou S,Wheelhouse N,Cuschieri K,et al.The role of infection in miscarriage.Hum Reprod Update,2016,22:116-133.
26 Zavan B,De Almeida EM,Salles Éda S,et al.COX-2 plays a role in angiogenic DBA(+) uNK cell subsets activation and pregnancy protection in LPS-exposed mice.Placenta,2016,44:34-45.
27 Kuon RJ,Togawa R,Vomstein K,et al.Higher prevalence of colonization with Gardnerella vaginalis and gram-negative anaerobes in patients with recurrent miscarriage and elevated peripheral natural killer cells.J Reprod Immunol,2017,120:15-19.
28 El-Badawy O,Helmy AS,Abbas AM,et al.Concordance between peripheral and decidual NK cell subsets and killer immunoglobulin-like receptors in women with recurrent spontaneous miscarriages.J Reprod Immunol,2020,140:103130.
29 Le T,Reeves RK,McKinnon LR.The functional diversity of tissue-resident natural killer cells against infection.Immunology,2022,167:28-39.
30 Quillay H,El Costa H,Duriez M,et al.NK cells control HIV-1 infection of macrophages through soluble factors and cellular contacts in the human decidua.Retrovirology,2016,13:39.
31 Yeh CC,Chao KC,Huang SJ.Innate immunity,decidual cells,and preeclampsia.Reprod Sci,2013,20:339-353.
32 Hanna J,Goldman-Wohl D,Hamani Y,et al.Decidual NK cells regulate key developmental processes at the human fetal-maternal interface.Nat Med,2006,12:1065-1074.
33 De Oliveira LG,Lash GE,Murray-Dunning C,et al.Role of interleukin 8 in uterine natural killer cell regulation of extravillous trophoblast cell invasion.Placenta,2010,31:595-601.
34 Liu W,Liu X,Luo M,et al.dNK derived IFN-γ mediates VSMC migration and apoptosis via the induction of LncRNA MEG3:A role in uterovascular transformation.Placenta,2017,50:32-39.
35 Hwang JH,Lee MJ,Seok OS,et al.Cytokine expression in placenta-derived mesenchymal stem cells in patients with pre-eclampsia and normal pregnancies.Cytokine,2010,49:95-101.
36 Chen LJ,Han ZQ,Zhou H,et al.Inhibition of HLA-G expression via RNAi abolishes resistance of extravillous trophoblast cell line TEV-1 to NK lysis.Placenta,2010,31:519-527.
37 Barbaro G,Inversetti A,Cristodoro M,et al.HLA-G and recurrent pregnancy loss.Int J Mol Sci,2023,24:2557.
38 Zhuang B,Shang J,Yao Y.HLA-G:An Important mediator of maternal-fetal immune-tolerance.Front Immunol,2021,12:744324.
39 Shreeve N,Depierreux D,Hawkes D,et al.The CD94/NKG2A inhibitory receptor educates uterine NK cells to optimize pregnancy outcomes in humans and mice.Immunity,2021,54:1231-1244.e4.
40 El-Azzamy H,Dambaeva SV,Katukurundage D,et al.Dysregulated uterine natural killer cells and vascular remodeling in women with recurrent pregnancy losses.Am J Reprod Immunol,2018,80:e13024.
41 Ebina Y,Nishino Y,Deguchi M,et al.Natural killer cell activity in women with recurrent miscarriage:Etiology and pregnancy outcome.J Reprod Immunol,2017,120:42-47.
42 Guo W,Fang L,Li B,et al.Decreased Human Leukocyte Antigen-G Expression by miR-133a contributes to impairment of proinvasion and proangiogenesis functions of decidual NK cells.Front Immunol,2017,8:741.