囊胚培养因能对胚胎进行无创伤体外筛选，已成为目前提高胚胎种植率和妊娠率的最有效措施[1]。有研究表明，与卵裂期胚胎移植相比，囊胚移植存在增加单卵双胎率的风险[2,3]。单卵双胎围产期发病率和死亡率显著高于双卵双胎[4]。因此，囊胚移植是否增加单卵双胎的问题成为辅助生殖技术研究的热点。本研究回顾性分析了行体外受精/卵胞浆内单精子注射获得妊娠的患者资料，探讨囊胚移植与单卵双胎的关系，为单囊胚移植技术提供临床数据。
对象与方法
一、对象
回顾性分析2009年1月—2011年12月在广西壮族自治区妇幼保健院生殖中心进行体外受精-胚胎移植术(In vitro fertilization，IVF-ET)/卵胞浆内单精子显微注射(intracytoplasmic sperm injection, ICSI)患者的资料，共2 587个新鲜周期，获得临床妊娠1 175个周期。根据移植胚胎的发育阶段，分为卵裂期胚胎移植组和囊胚移植组。两组年龄、原发不孕比例、不孕年限、临床妊娠率、移植日内膜厚度及受精方式比较，差异均无统计学意义，见表1。
二、方法
1.超排方案及卵子收集：采用促性腺激素释放激素拮抗剂(GnRHa)+卵泡刺激素(FSH)或人绝经期促性腺激素(HMG)控制性超排卵。当主导卵泡达18 mm时，肌注6 000～10 000 U的人绒毛膜促性腺激素(hCG)，36～38 h后在B超介导下经阴道取卵，所得卵母细胞培养2～6 h进行受精处理。
表1 一般资料
2.精液处理与受精：于取卵当天收集男方精液，根据收集的精液情况，采用梯度离心法或直接离心处理精液。IVF患者精子经上游法处理后制作受精皿，进行IVF；ICSI患者精液离心后制作操作皿，进行ICSI。行IVF治疗的患者取卵后2～6 h即可将卵子加到预先制作并平衡1 h以上的受精滴中；行ICSI治疗的患者取卵后2～6 h将卵丘复合物置于80～100 U/ml透明质酸酶溶液中消化去除卵丘细胞，选择排出第一极体且胞质均匀的成熟卵子行ICSI。16～18 h观察受精情况。
3.胚胎评价：第3天根据胚胎形态对胚胎进行评分。优质胚胎(优胚)指细胞碎片≤30 %，卵裂球数目≥5个且形态规则或稍不规则，有发育速度；非优质胚胎(差胚)，即细胞碎片>30 %或第2天和(或)第3天发育停滞的胚胎。
4.胚胎移植：根据患者的意愿选择卵裂期移植或囊胚移植，第3天行卵裂期胚胎移植；对选择囊胚移植患者的胚胎延长培养至第5天或第6天，根据Gardner囊胚分级系统[5]，对囊胚进行分级，选择优质的囊胚进行移植。均在B超引导下进行。
5.黄体支持及妊娠检查：取卵后肌内注射黄体酮60～80 mg/d。移植后12～14 d，查血hCG，若阳性，诊断为生化妊娠；移植后21～28 d，B超下见妊娠囊诊断为临床妊娠。
6.单卵双胎的诊断：出现以下2种情况者可诊断为单卵双胎。(1)B超见孕囊数目大于所移植胚胎数目(双绒毛膜双胎)；(2)B超见同一孕囊内有2个胚芽(单绒毛膜双胎)。
7.统计学处理：采用SPSS 13.0 软件进行分析。计量资料以
表示，采用独立样本t检验，计数资料采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。
结 果
一、两组单卵双胎发生率
卵裂期胚胎移植组移植胚胎数多，多胎妊娠率高，与囊胚移植组比较，差异有统计学意义；两组单卵双胎率差异无统计学意义；见表2。
表2 两组单卵双胎发生率比较
注：两组比较，*P<0.05
二、两组单卵双胎患者的临床结局
卵裂期胚胎移植组活胎分娩率为66.7 %(12/18)，其中7例单卵双胎分娩13个婴儿(有1例自然减1胎),5例单卵双胎合并另1单胎妊娠分娩9个婴儿(1例人工减胎，由3胎减到2胎；4例自然减胎，3例由3胎减到2胎，1例由3胎减到1胎)，共分娩婴儿22个，低体重儿占50.0 %(11/22)；囊胚移植组活胎分娩率为70.6 %(12/17)，共分娩23个婴儿(有1例自然减1胎)，低体重儿占78.3 %(18/23)。两组单卵双胎的流产率、活胎分娩率、早产率及低体重儿出生率等差异均无统计学意义，见表3。
表3 两组单卵双胎的临床结局比较
讨 论
自然妊娠单卵双胎的发生率为0.42 %，辅助生殖技术导致单卵双胎率明显升高[6]。本研究卵裂期胚胎移植和囊胚移植的单卵双胎率分别为2.6 %和3.6 %，均远远高于自然妊娠的单卵双胎发生率，与其他报道基本相符[7～9]。
Kawachiya等[10]回顾性分析了单胚胎移植表明，囊胚移植的单卵双胎率高于卵裂期胚胎移植。Chang等[7]的一项Meta分析显示，囊胚移植的单卵双胎发生率(1.64 %)高于卵裂期胚胎移植(0.41 %)。Papanikolaou等[8]研究表明，单囊胚移植不增加单卵双胎的风险(囊胚移植为1.8 %，卵裂期移植为2.6 %)。本研究亦表明，囊胚移植未增加单卵双胎率(囊胚移植为3.6 %，卵裂胚移植为2.6 %)，且流产率、活胎分娩率、早产率及低体重儿出生率也未升高。事实上，辅助生殖技术中真正的单卵双胎率并不十分清楚。各类报道诊断单卵双胎均是基于孕囊或胚芽超过移植胚胎数目。这种方法在移植超过1个胚胎的情况下并不能有效区分单卵双绒毛膜双胎与双卵双胎。确定单卵双胎的金标准是DNA分析，但目前无DNA分析进行单卵双胎诊断的数据分析。
辅助生殖技术中单卵双胎发生的病因学不清。Sills等[11]认为，单卵双胎的发生与促排卵后透明带变硬相关。Carrilo-Vadillo等[12]认为与透明带上的切口相关。最近研究并没能证明卵胞浆内单精子注射或辅助孵化与单卵双胎相关。另外一个大家关注的因素是体外培养时间的延长导致单卵双胎率增加。但是部分研究认为并不是体外培养时间的延长导致的，而是培养环境的变化[13]。例如培养基中含有足量的葡萄糖、经产生大量的氧自由基诱导凋亡，导致内细胞团破裂，产生双胎。Steinman等[14]提出胚胎长时间处于低钙的培养环境中，易使内细胞团不稳定而分裂。此外，单卵双胎的家族聚集性现象也被描述，表明遗传因子也是影响因素之一[15]。Moayeri等[16]研究描述了一个连续8年的趋势，随着囊胚培养体系的完善，单卵双胎率逐渐下降。随着单囊胚移植策略的完善及囊胚培养体系的进一步优化，单卵双胎率势必会逐渐降低。
参考文献
1 Papanikolaou EG,D'haeseleer E,Verheyen G,et al.Live birth rate is significantly higher after blastocyst transfer than after cleavage-stage embryo transfer when at least four embryos are available on day 3 of embryo culture.A randomized prospective study.Hum Reprod,2005,20:3198-3203.
2 da Costa AL AL,Abdelmassih S,de Oliveira FG,et al.Monozygotic twins and transfer at the blastocyst stage after ICSI.Hum Reprod,2001,16:333-336.
3 Steinkampf MP,Dharia SP,Dickerson RD.Monozygotic twins discordant for vaginal agenesis and bilateral tibial longitudinal deficiency.Fertil Steril,2003,80:643-645.
4 Aston KI,Peterson CM,Carrell DT.Monozygotic twinning associated with assisted reproductive technologies: a review.Reproduction,2008,136:377-386.
5 Gardner DK，Lane M，Stevens J，et al.Blastocyst score affects implantation and pregnancy outcome: towards a single blastocyst transfer.Fertil Steril,2000,73:1155-1158.
6 Toledo MG..Is there increased monozygotic twinning after assisted reproductive technology?Aust N Z J Obstet Gynaecol,2005,45:360-364.
7 Chang HJ,Lee JR,Jee BC,et al.Impact of blastocyst transfer on offspring sex ratio and the monozygotic twinning rate: a systematic review and meta-analysis.Fertil Steril,2009,91: 2381-2390.
8 Papanikolaou EG,Fatemi H,Venetis C,et al.Monozygotic twinning is not increased after single blastocyst transfer compared with single cleavage-stage embryo transfer.Fertil Steril,2010,93:592-597.
9 Knopman J,Krey LC,Lee J,et al.Monozygotic twinning: an eight-year experience at a large IVF center.Fertil Steril,2010,94:502-510.
10 Kawachiya S,Bodri D,Shimada N,et al.Blastocyst culture is associated with an elevated incidence of monozygotic twinning after single embryo transfer.Fertil Steril,2011,95:2140-2142.
11 Sills ES,Moomjy M,Zaninovic N,et al.Human zona pellucida micromanipulation and monozygotic twinning frequency after IVF.Hum Reprod,2000,15:890-895.
12 Carrillo-Vadillo R,García-Lozano JC,Lozano Arana MD,et al.Two sets of monozygotic twins after intracytoplasmic sperm injection and transfer of two embryos on day 2.Fertil Steril,2007,88:1676,e3-5.
13 Ménézo YJ,Sakkas D..Monozygotic twinning: is it related to apoptosis in the embryo?Hum Reprod,2002,17:247-248.
14 Steinman G.Mechanisms of twinning.II.Laterality and intercellular bonding in monozygotic twinning.J Reprod Med,2001,46:473-479.
15 Steinman G.Mechanisms of twinning.VI.Genetics and the etiology of monozygotic twinning in in vitro fertilization.J Reprod Med,2003,48:583-590.
16 Moayeri SE,Behr B,Lathi RB,et al.Risk of monozygotic twinning with blastocyst transfer decreases over time: an 8-year experience.Fertil Steril,2007,87:1028-1032.