人类早期胚胎体外发育的影响因素

人胚胎体外培养的研究表明，大约有50 %的人胚胎在发育至胚泡期之前停止发育，该时期恰好是贮存在胚胎细胞中源自母系的mRNA失活或降解、胚胎细胞自身基因组应该被激活的临界期,胚胎在这时对环境压力、体外培养条件非常敏感。早期胚胎间的细胞因子协同作用、体外培养环境、胚胎自身的营养代谢需求及基因表达等影响体外胚胎的发育潜能已引起人们的重视。

一、促排卵对胚胎发育的影响

不同的超促排卵方案会影响卵子的数目与质量、胚胎的质量和代谢。实验动物的研究证实，使用外源性促性腺激素促排卵能影响不同时期胚胎的发育，其作用可能由细胞因子所介导[1-2]。但目前关于促排卵直接影响人类胚胎的报道极少。促排卵时，高浓度的促卵泡生成素可能对胚胎发育无益，而高浓度雌二醇对胚胎质量可能并没有不良影响。在卵巢过度刺激的病人中进行卵母细胞和胚胎质量的研究发现，胚胎质量并不受到不良影响[3]。对自然周期和促排卵周期中胚胎的质量进行回顾性分析发现，其胚胎质量及卵裂能力也没有差别[4]。不同的促排方案和促排药物对胚胎质量的影响也成为研究热点。郭慧等[5]在卵巢低反应患者中的COH研究中认为：超短方案一过性升高(flare—up)作用导致卵泡早期黄体生成素(LH)和雄激素的过度释放和分泌直接影响卵子的质量，使胚胎的质量下降，种植率降低，应用长效GnRH-a预处理的改良超长方案中GnRH-a预治疗可降低腹腔中对胚胎产生毒性作用的自细胞介素-1和肿瘤坏死因子的浓度，有利于胚胎的着床，对卵巢低反应患者的妊娠结局有明显的改善作用。而对于高龄妇女，长方案能获得更好获卵数及胚胎数；拮抗剂方案虽然获卵数偏少，但能提高卵泡质量进而增加优质胚胎率，同时能减少Gn使用量，减轻患者经济负担；短方案的临床结局较差[6]。在反复IVF失败、胚胎质量均差的患者拮抗剂方案治疗前使用超短效激动剂方案，与患者以往所用方案比较，可获得相对多的优质胚胎，妊娠率也提高[7]。还有学者发现在各种超促排卵方案中，在卵泡早期或中晚期添加低剂量hCG，均可改善卵子和胚胎质量，获得更高的种植率和妊娠率[8]。有关促排卵对胚胎发育影响需要更深入的研究，如多种不同的促排卵方法对IVF胚胎非整倍体发生率的影响等，有待进一步阐明。

二、胚胎培养系统

在配子及胚胎质量良好的基础上，体外培养的环境条件关系到其生长发育的成败。体外培养需要模拟体内环境，以便让配子及早期胚胎能够在更接近生理的条件下生长发育，从而获得与体内胚胎更加接近的发育潜能，以提高妊娠率。因此创建和维持与人体内部相似的培养条件，就成为胚胎体外正常发育的关键。

1．培养方式对胚胎发育的影响：近年来，共培养体系被认为是促进胚胎发育的理想的培养方式。胚胎共培养中的辅助细胞可以提高目的细胞的发育，从而更好地满足胚胎在不同细胞期对物质的需求。采用共培养的方式培养胚胎，建立更类似于体内环境的培养体系，使细胞间能相互沟通信息，相互支撑生长增殖，使胚胎的体外发育率得到大大的提高，从而避免早期胚胎的发育阻滞。有研究显示用人体子宫内膜细胞与体外受精胚胎共培养，与在传统培养液中单独培养相比，胚胎细胞数显著增加，胞质碎片率明显下降，培养至囊胚阶段的胚胎数增加，种植率和妊娠率得到了提高[9]。除此之外，共培养体系促进早期胚胎发育的另一原因是其可代谢降解胚胎发育过程中产生的铵、次黄嘌呤和氧自由基等有毒物质，Tan等[10]研究结果表明，共培养细胞能降低培养液中的次黄嘌呤浓度，消除其对胚胎发育的抑制作用。Joo等[11]通过小鼠的胚胎与人输卵管细胞共培养时发现，共培养组的氧自由基浓度比对照组明显降低，提示共培养能降低培养体系中的氧压和氧自由基使胚胎克服发育阻断。不同时期胚胎共培养的细胞选择应有所不同,建立更类似于体内环境的培养体系，因此采用先与输卵管上皮细胞再与子宫内膜细胞共培养的序贯方案可能更合理，可以有效地提高体外受精胚胎的囊胚发育率[12]。

2．能量物质对胚胎发育的影响：体外受精胚胎发育中最重要的营养物是碳水化合物、血清和氨基酸，它们不仅能提供能量而且能提高胚胎的抗应激性，阻止体外不良因素对细胞的刺激而维持胚胎的功能。成俊萍等[13]研究发现，非必需氨基酸可显著提高水牛卵母细胞IVF后胚胎的分裂率，但对囊胚发育率无显著影响；低浓度的必需氨基酸对水牛IVF胚胎的发育具有一定促进作用，但高浓度则有抑制作用；在培养液中添加维生素，水牛IVF胚胎的分裂率和第7天囊胚发育率显著提高。因此，胚胎内能量物质的代谢水平可作为胚胎发育力和生命力的一个有效指标。

3．物理因素对胚胎发育的影响：Susan等[14]研究表明，卵子暴露于室温10 min时有一半的卵细胞发生纺缍丝崩解，30 min后全部崩解,这种改变仅从一般的形态学上是难以观察到的。而且早期胚胎对正常实验室光线耐受性差。因此胚胎体外正常发育需要适宜的温度、严密控制的气相及严格的实验室光线。

三、卵子的数量和质量

Huang等[15]认为卵子的成熟度与囊胚的形成和发育直接相关。而卵母细胞的发育主要受促性腺激素(Gn)、卵泡液中的甾体激素[16]等各种激素作用及卵母细胞的大小、取卵时间、供卵者年龄等内在因素的影响。此外，环腺苷-磷酸、蛋白激酶A、尿素、卵母细胞基质金属蛋白酶、卵泡细胞组织抑制素金属蛋白酶等，对卵母细胞的体外成熟也有调节作用[17-18]。研究发现第一极体的形态与卵子质量之间有着密切相关性，光滑、没有碎片、没有退化的极体往往预示优质卵母细胞和好的发育潜能[19]。而线粒体的DNA拷贝数也直接影响着卵母细胞的质量、受精过程和随后的胚胎发育。发育潜能较高的卵子的线粒体在细胞质中多呈均匀分布，但在大部分发育潜能较低的卵子中，线粒体仍然维持周边分布。提示缺乏线粒体在胞质中的重新分布是胞质未成熟的标志，与较低的卵子发育潜能密切相关[20]。同样第二极体排出时间早晚影响胚胎的发育潜能。丁晓芳等[21]发现受精5 h内排出第二极体的卵子其总受精率、正常受精率以及所发育的胚胎质量均显著高于第二极体出现晚的卵子，因此对受精5 h的卵子进行第二极体观察有助于早期预测患者本次IVF-ET周期胚胎的发育潜能。

四、人合子原核构型及早期卵裂

受精卵原核的形态及核仁分布及多少，胚胎卵裂的时间，原核与极体的构型关系及是否出现胞浆晕，第3天细胞胚胎的数量及胚胎的碎片程度等[22] 均能够预示胚胎发育潜力。其中方丛等[23]研究表明移植早期卵裂胚胎可以提高IVF-ET的成功率，并提高妊娠率。由于原核对胚胎的进一步发育及种植和怀孕有一定的预示作用，所以在近来的一些研究中，原核的形态学引起了广泛的关注。在卵裂之前，原核必须平行于极体[24]，因此可以推测原核的构型对卵裂的发生一定存在某种作用，已报道在合子卵裂前，原核将向第二极体方向旋转为合子卵裂做好准备[25]。最新的研究成果表示，胚胎呈现出非常规的分裂模式，那么受孕可能性要降低很多。如果胚胎在不到5 h(参照正常的卵裂时间)内产生二次分裂，其较“正常”发育中的胚胎的移植成功率显著降低。产生短期二次分裂的胚胎就是没有充足的时间进行DNA复制，而这却是正常细胞分裂的先决条件。

五、胚胎碎片

对于细胞碎片产生的机制尚不十分明确。受精时高密度精子导致培养液自由基水平过高、温度或pH 值改变、超促排卵刺激都可能是造成胚胎碎片产生的原因。通过扫描电镜观察发现, 碎片的表面有许多形状不规则的空泡和突出, 类似体细胞凋亡(编程死亡) 的改变。而正常卵裂球表面是由短的规则的微绒毛组成, 所以推测碎片产生可能与胚胎细胞的凋亡有关。目前尚无实验证明碎片本身对胚胎的发育影响不大, 但碎片增多往往伴有细胞大小不均和正常卵裂球数目减少, 预示胚胎的质量差。研究表明D3碎片程度与D3移植妊娠率及植入潜能有紧密关系[26]。但是D3胚胎中<10 %的碎片对胚胎植入率的影响可以忽略不计，而高碎片的胚胎严重降低植入率，并且与新生儿高畸形率相关。因为随着碎片程度的增高，非整倍性的概率增加，在非碎片胚胎与碎片大于35 %的胚胎中，染色体异常率可由50 %～60 %增加到70 %～90 %[27]。

六、人类胚胎致密化基因表达差异

胚胎致密化是哺乳动物早期胚胎发育过程中的第一个细胞分化事件，导致了内细胞团及滋养外胚层的产生。胚胎致密化作为早期胚胎发育中的一个非常重要的阶段，是胚胎得以继续发育的关键。致密化相关基因的激活及正常表达对随后胚胎的发育效率和质量有着至关重要的作用。在目前技术条件下，体外培养的胚胎许多不能进行有效的致密化，这可能是导致囊胚形成率和囊胚质量低的主要因素。研究发现，与体内发育的胚胎相比，体外培养发育的胚胎表现出明显不同的致密化过程，致密化相关基因的表达也出现差异[28]。在人类胚胎上的研究亦表明，缝隙连接蛋白43(Cx43)的异常表达和分布影响胚胎的存活潜能[29]。Cx43的表达水平是胚胎质量的重要标志。此外，上皮钙调素蛋白(E-cad)表达的缺失或其功能得不到正常发挥，胚胎在桑椹胚或囊胚期的发育将出现异常[30]。

七、细胞因子对胚胎发育的影响

近年来细胞生长因子参与胚胎发育和着床的功能研究十分热门，细胞生长因子发挥改善胚胎发育、启动胚胎着床、调节植入过程等强大作用。

1．白血病抑制因子(LIF)：(1)抑制内细胞团的分化，维持胚胎的多潜能性。(2)刺激内细胞团和滋养外胚层的增殖。研究表明，颗粒细胞和原始卵泡及初级卵泡周围的卵丘细胞含LIF蛋白水平均比卵母细胞高，在培养的颗粒细胞中用LIF处理增加Kitligand(KL)mRNA的表达，KL已经显示能提高卵巢细胞生长和诱导原始卵泡的发育。LIF同KL相互作用可以增加LIF的活力，以提高原始卵泡到初级卵泡的转化[31]。在无血清培养液中加入少量LIF，可明显增加卵裂率和卵裂胚胎的质量，显著促进桑椹胚期和胚泡期胚胎的发育，显著的提高胚胎的发育率、植入率和妊娠率[32]。

2．干细胞因子(SCF)：近年来的研究发现SCF及其受体对胚胎的生长分化同样起调控作用。赵振华等[33]发现，添加SCF极显著的提高卵母细胞的成熟率，主要原因在于SCF刺激细胞分化和增殖。赵海波等[34]实验结果也显示，受精卵子的卵泡液SCF水平明显高于未受精卵子，优质胚胎的卵泡液SCF水平明显高于劣质胚胎。所以，卵泡液中SCF水平也间接影响着卵子的受精率和胚胎质量，较高水平的SCF有利于卵子的受精和优质胚胎的形成。

3. 可溶性人类白细胞抗原G(sHLA-G)分子：胚胎与胚胎培养液中含有胚胎在围着床期程序化分泌的各类生物活性分子,为进行胚胎发育潜能的评估提供了适宜平台,其中备受关注的是由绒毛外细胞滋养层细胞分泌的可溶性人类白细胞抗原G(sHLA-G)分子。sHLA-G与蜕膜组织中的淋巴细胞、NK细胞和巨噬细胞相互作用,通过调节细胞因子分泌、控制滋养层侵入和促进螺旋动脉血管重构等机制,在着床点构建了介导胚胎植入和维持妊娠的免疫耐受环境。

4．胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)：Nagano等[35]将神经营养因子(GDNF)添加到精原细胞的培养基中有助于精原细胞分裂增殖和初级精母细胞形成精子细胞。另外在成熟培养液中添加15IU/ml的GDNF也有效提高了山羊卵母细胞的成熟率和胚胎的早期发育[33]。

5．各类生长因子：在细胞生长因子发挥作用的网络中，生长因子起着举足轻重的作用。目前研究较多的是胰岛素样生长因子(IGF)、β-转换生长因子、表皮生长因子(EGF)等。共培养体系中体细胞分泌一些促进胚胎早期发育的物质。最有可能的物质为一些生长因子,如转化生长因子α及β(TGF-α和TGF-β)、成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子(IGF)等。Waston等用反转录扩增法证明,在培养的体细胞中有IGF、FGF、TGF-α和TGF-β的mRNA的转录[36]。因此早期发育较好的胚胎中存在生长因子受体的表达。表皮生长因子(EGF)在多种哺乳动物中都表现出对着床前胚胎发育具有调节作用。研究表明滋养层细胞和子宫内膜上都证实有EGF和EGF-R，EGF能够刺激体外培养胚胎的卵裂，使之更快发育至囊胚期。而EGF-R的数量或功能状态可能是胚胎被激活以及着床的先决条件[37]。

6．单胚胎Le～Y寡糖：细胞表面的Le～Y寡糖在胚胎发育过程的表面表达，至胚泡期呈高峰，不仅在着床期母胎识别中起重要的中介作用，并且作为信息分子参与着床网络的调节。石英等[38]首次应用单胚胎蛋白分泌免疫印迹方法，直接证明了单胚胎的Le～Y寡糖分泌水平与胚胎的发育和着床能力密切相关，可以作为胚胎的功能性标志物，对胚胎的功能进行预测。

7.其他因素：如实验室操作情况、男性不育的有关因素等。 体外受精后缩短精-卵共培养时间可以提高胚胎质量，长时间的精-卵共培养对优质胚胎的形成有不利影响。许多研究表明，卵丘细胞的存在能增加卵母细胞的体外受精率、卵裂率和胚胎的后续发育能力。正确把握早受精观察时机，适时地提前去除卵丘细胞将可能获得更好的胚胎。而不同的男性不育引起相应的精液质量、精子活力及功能的改变从而选择不同的受精方式，也影响了胚胎的发育。如精子染色体异常、免疫性不育可导致胚胎发育阻滞。

八、展望

卵子、精子自身质量对胚胎发育起主导作用，体外培养环境只能做到尽可能不干扰和破坏胚胎的发育，而不能改善或扭转劣质胚胎的发育潜能。体外培养的胚胎质量与体内胚胎相比仍有很大差距，胚胎移植后妊娠率低、流产率高等。造成这一差异的主要原因是现有的各种培养系统还无法完全模仿体内环境，适应早期胚胎分化发育的需求。因此有必要深入研究早期胚胎的发育。如，对人类胚胎致密化前和致密化后mRNA差异的研究，非侵入性选择高发育潜能胚胎的方法的建立、细胞因子功能的研究，并进而寻找胚胎发育和着床的决定性因素，即胚胎的功能性标志物等，将为深入了解人类植入前胚胎的囊胚形成机理、通过致密化基因表达进行胚胎质量评价以及更深入的了解体内胚胎的生存环境，及改善体外培养条件奠定基础，为进一步将这些发育重要基因的表达及胚胎体外培养体系优化相结合提供有意义的指导。

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