四跨膜蛋白超家族(transmembrane 4 superfamily，TM4SF)，也叫四分子交联体家族(tetraspanins)，是一种古老的小跨膜蛋白家族，在原生生物进化过程中已经出现[1]。TM4SF在人类由33个成员组成，在果蝇和秀丽隐杆线虫中则分别有37和20种成员，它们在不同的组织中表达，并作用于细胞迁移、黏附和融合的生理和病理过程中[2-3]。但并非所有包含四个跨膜结构域的蛋白质都是四分子交联体家族的成员，TM4SF分子中必须包含如图1[4]强调的保守残基。四跨膜蛋白的特征是含有一个特定的、进化上保守的蛋白结构，包括四个跨膜结构域、细胞内N-和C-末端、一个很短的胞内环，以及两个胞外环，即小环和大环[5]。大胞外环由大约120个氨基酸组成，在蛋白质-蛋白质相互作用的建立中起着核心作用[6-7]。它由可变部分和一个保守的头域组成。检测四跨膜蛋白CD81的晶体结构和其他四跨膜蛋白的系统发育分析显示，在头域中有三个严格保守的成份：两个二硫键，一个由半胱氨酸构建的不变的CCG域，和几个高度保守的甘氨酸、脯氨酸和酪氨酸残基[7]。这些成份为蛋白质-蛋白质间的相互作用，特别是与整合素的结合提供了特定的界面[8-9]。此外，几乎所有的四跨膜蛋白都是由近膜端半胱氨酸残基的棕榈酰化来修饰，棕榈酰化对于TM4SF组织多分子跨膜蛋白复合体(TEMs)有重要影响，这有助于跨膜四蛋白-跨膜四蛋白相互作用的建立[10]。
一、Tspan-5的结构及其参与的病理生理过程
四分子交联体Tspan-5(tetraspanin 5)，又称为TM4SF9或NET-4，是一个含有268个氨基酸的多跨膜蛋白，属于四分子交联体家族，在细胞发育、分化、生长和迁移相关的细胞信号转导中起着重要作用。Tspan-5由基因Tm4sf9编码，在人类其编码基因位于4q23，而在小鼠中则位于3H1。有关Tspan-5参与的病理生理过程，见表1。
1.Tspan-5参与神经细胞分化成熟：Garcia-Frigola等[11]利用消减杂交方法鉴定小鼠大脑皮质发育的相关基因，通过分离含有完整编码区的cDNA片段(3.1 kb)，经核苷酸序列分析显示，小鼠Tspan-5与其人类同源体98%的氨基酸序列相一致。他们发现Tspan-5显著表达于成年小鼠的大脑新皮质、海马、杏仁核和小脑浦肯野细胞中，这暗示Tspan-5在维护人脑功能中的作用。随后Garcia-Frigola等[12]又发现Tspan-5在小鼠不同发育阶段表达，从胚胎期第10天(E10)第一次看见Tspan-5表达并持续至成年。在整个发育阶段，Tspan-5在皮质区和浦肯野细胞中显著表达，同时在发育中的心脏、前肢和后肢中也检测到Tspan-5的转录。
图1 FM4SF的分子结构示意图
表1 Tspan-5参与的病理生理过程
Juenger 等[13]在2005年使用原位杂交对出生后FVB/ N小鼠小脑进行了详细的表达分析，他们发现Tspan-5mRNA在出生后小脑浦肯野细胞(PC)的整个发育过程中均表达，并随着不断发育其表达水平发生显著改变。在出生当天(P0)，Tspan-5mRNA在PC中水平表达非常低，在生后第7天(P7)Tspan-5mRNA的表达在所有的PC均可见，且后小叶相比前小叶的更为突出。在P7后，所有的PC都可见到高水平的Tspan-5mRNA表达。这表明Tspan-5mRNA的水平是与PCs的发育阶段相关。此外，尽管在增殖颗粒细胞层并未检测到Tspan-5mRNA的信号，但在细胞有丝分裂后、迁移前的颗粒细胞发现了低含量的信号，而在定居和分化的颗粒细胞中发现高水平的信号。因此，Tspan-5mRNA的表达水平与神经细胞的分化状态密切相关，Tspan-5表达水平对神经元成熟的不同阶段可能是重要的。
2.Tspan-5影响肿瘤细胞的转移和侵袭力：研究表明四跨膜蛋白的过度表达会影响多发性骨髓瘤(MM)细胞的存活和侵袭能力，TM4SF成员CD81/CD82能通过减少分泌的MMP-9活性来降低MM细胞的迁移能力和侵袭潜能[14]。耿焱[15]在2008年研究发现大肠癌细胞中有Tspan-5表达，且在不同转移潜能的大肠癌细胞株中其表达存在差异，进一步研究表明Tspan-5可以影响大肠癌细胞的转移能力。
3.Tspan-5调节破骨细胞的生成：研究发现Tspan-5和NET-6分别从正向和负向调节破骨细胞的生成，破骨细胞分化因子(RANKL)通过改变Tspan-5和NET-6的平衡来调节破骨细胞的产生。数据表明，在破骨细胞的前体中表达出四跨膜蛋白的多样性，破骨细胞形成过程中的细胞融合是通过不同的TM4SF成员如Tspan-5和NET-6相互合作管理的；其对破骨细胞发挥重要作用的疾病，如类风湿关节炎和骨质疏松症，四跨膜蛋白家族功能的改变可能具有治疗的潜力[16]。
4.Tspan-5增强滋养细胞侵袭力并参与胚胎发育：Koopman等[17]采用微阵列芯片分析技术比较蜕膜NK细胞(dNK)和外周NK细胞(pNK)，结果显示在dNK细胞上特异性表达Tspan-5、CD9和CD151，以及整合素子集αD、αX、β1和β5，提示Tspan-5可能与整合素共同参与母胎界面免疫耐受，调节胚胎着床和维持妊娠，但仍需进一步研究探讨其中的机制。高天旸等[18]应用免疫组化方法检测发现TM4SF9蛋白主要表达于母胎界面具有侵袭性的绒毛外滋养层细胞以及增生活跃执行侵袭功能的滋养细胞，随着增生程度、侵袭性的增强，TM4SF9蛋白在正常早孕绒毛、部分性葡萄胎、侵蚀性葡萄胎，绒癌中的表达逐渐增强。同时，高天旸等[19]通过RNA干扰技术建立的TM4SF9表达水平稳定下调的JEG-3细胞株，实验检测细胞迁移和侵袭性，发现下调TM4SF9表达水平后，JEG-3细胞株异质黏附性和异质运动性均减弱。这都提示TM4SF9蛋白表达水平与滋养细胞的侵袭行为相关。TM4SF9适度表达有利于妊娠的维持，表达过度则可能导致侵袭性葡萄胎、绒癌等。
最近，Kashef等[20]通过定量实时PCR和原位杂交检测在非洲爪蟾的胚胎发育过程中，发现4个相关TM4SF成员的时空基因表达是Tspan-3(由基因Tm4sf8编码)、Tspan-4(由基因Tm4sf7编码)、Tspan-5(由基因Tm4sf9编码)和Tspan-7(由基因Tm4sf2编码)。这些基因首先出现在脊椎动物的进化过程中，且在不同的物种是保守的。在非洲爪蟾的发育过程中，尽管Tspan-3、Tspan-4和Tspan-7在不同的时间发生，却表现出非常相似的空间表达模式，相应的转录子被发现在囊胚期的动物背部外胚层；在早期尾牙阶段，基因表达在位于体节、显影眼、脑和耳囊泡中的迁移颅神经嵴，表明三者密切关联。相比之下，Tspan-5最早出现在发育阶段的晚些时候，并在脊索中明显检出。这些四跨膜蛋白在细胞中具有高迁移性潜力，如表达神经嵴细胞，提示它们在发育期间迁徙过程的调控作用。另外，表达谱的相似性表示至少部分功能冗余(functional redundancy)的可能，即两个或多个基因享有相同的功能，灭活或敲除其中一个不会影响或很少影响其表型。这与在敲除TM4SF成员的研究中组织限定或表型缺失的早期结果相一致。
二、Tspan-5发挥生物效应的可能分子机制
有文献报道，TM4SF不仅可以募集脂膜上的细胞信号进入蛋白质复合体，还可以使胞内信号分子(PI4K、PKC 等)向整合素接近，参与整合素胞质尾的磷酸化，从而直接连接胞外整合素α链和PKC，形成TM4SF-PKC-整合素复合体[21-22]，参与滋养层细胞侵袭性的调节。而且有研究证实PKC是Notch转运的关键调节因子，并证明在细胞内路由的不同步骤是根据Notch信号状态进行差异调制。Notch进化上保守的信号转导系统，Notch信号传导通路是影响细胞命运决定的重要通路之一，相邻细胞间通过Notch受体传递信号可以调节多种细胞的分化、增殖和凋亡，影响器官形成和形态发生。当Notch被激活时，PKC促进Notch从晚期胞内体重定位到细胞核并增强Notch胞内结构域的生产，从而增强Notch的活性；在非激活状态，PKC不是促进Notch受体内吞，而是伴随着泛素化的增加并与胞内体分选蛋白Hrs相互作用[23]。Dunn等[24]在秀丽隐杆线虫中使用基因检测证明TSP-12在多种细胞环境中都是Notch活性的利好因素，同时在使用细胞培养系统中，发现2种人类TSP-12同源物(Tspan-33和Tspan-5)促进Notch活性，并可能作用于γ-分泌酶裂解步骤。Notch的细胞质结构域是膜结合的转录因子，与配体结合最终导致跨膜结构域之内的γ-分泌酶解离，从而使细胞内结构域易位到细胞核并激活靶基因的转录(如图2)。作者他们还获得了在线虫和人类细胞中四跨膜蛋白质间功能冗余(functional redundancy)的证据。
图2 Notch信号通路
解聚素金属蛋白酶10(ADAM10)是一种普遍存在的跨膜金属蛋白酶，它能够从40多个不同的跨膜靶蛋白中水解胞外区，包括Notch和淀粉样前体蛋白，催化Notch受体的配体依赖的胞外域脱落并激活Notch。ADAM10对胚胎发育来说是必不可少的，在炎症、癌症和阿尔茨海默病中也是重要的。2012年Haining 等[25]使用免疫共沉淀证实了特定的ADAM10与TM4SF亚科TspanC8成员(Tspan-5、Tspan-10、Tspan-14、Tspan-15、Tspan17和Tspan33/Penumbra)之间的相互作用，这6个成员都促进ADAM10成熟，进化保守的TspanC8亚科直接与ADAM10相互作用，调节它从内质网的出口，而它们中的4个调节ADAM10表面表达水平，不同的细胞类型TspanC8表达的类型不同。这些结果表明四跨膜蛋白TspanC8是ADAM10成熟和转运到细胞表面的重要调节者。Dornier 等[26]进一步使用功能基因组电子扫描的方法(RNAi Screen)发现在果蝇中2种TspanC8基因为Notch的调节者，3个果蝇TspanC8基因(Tsp3A，Tsp86D和Tsp26D)在促进Notch信号中起着功能冗余作用。在卵子形成中，边缘细胞的TspanC8基因表达上调并调节Kuzbanian分布、Notch活性和细胞迁移。此外，人类TspanC8四跨膜蛋白Tspan-5和Tspan-14正调控配体诱导的ADAM10依赖的Notch1信号传导。因此，四跨膜蛋白TspanC8在ADAM10转运和活性的调节上有一个保守的功能，从而积极地调节Notch受体的激活(如图3)。
图3 Tspan-5发挥生物效应的可能分子机制
此外，有文献报道在人类蜕膜NK细胞(dNK)中检测到Tspan-5表达，而dNK细胞是一个具有免疫调节潜能的特殊子集，提示Tspan-5可能参与母胎界面免疫耐受，调节胚胎着床和维持妊娠[17]。
三、展望
目前对Tspan-5的研究尚浅，对其功能及机制知之甚少。进一步深入探索Tspan-5在细胞迁移和母胎界面中的作用及机制，不仅为妊娠相关疾病的诊治及人类不孕症的治疗提供理论基础，也对肿瘤转移机制的研究和癌症治疗提供新的思路。
参考文献
1 Garcia-Espana A,Chung PJ,Sarkar IN,et al.Appearance of new tetraspanin genes during vertebrate evolution.Genomics,2008,91:326-334.
2 Charrin S,Le Naour F,Silvie O,et al.Lateral organization of membrane proteins:tetraspanins spin their web.Biochem J,2009,420:133-154.
3 Todres E,Nardi JB,Robertson HM.The tetraspanin superfamily in insects.Insect Mol Biol,2000,9:581-590.
4 Hemler ME.Specific tetraspanin functions.J Cell Biol,2001,155:1103-1107.
5 Hemler ME.Tetraspanin functions and associated microdomains.Nat Rev Mol Cell Biol,2005,6:801-811.
6 Seigneuret M,Delaguillaumie A,Lagaudriere-Gesbert C,et al.Structure of the tetraspanin main extracellular domain.A partially conserved fold with a structurally variable domain insertion.J Biol Chem,2001,276:40055-40064.
7 Kitadokoro K,Bordo D,Galli G,et al.CD81 extracellular domain 3D structure:insight into the tetraspanin superfamily structural motifs.EMBO J,2001,20:12-18.
8 Rubinstein E.The complexity oftetraspanins.Biochem Soc Trans,2011,39:501-505.
9 Berditchevski F.Complexes of tetraspanins with integrins:more than meets the eye.J Cell Sci,2001,114:4143-4151.
10 Charrin S,Manie S,Oualid M,et al.Differential stability of tetraspanin/tetraspanin interactions:role of palmitoylation.FEBS Lett,2002,516:139-144.
11 Garcia-Frigola C,Burgaya F,Calbet M,et al.Mouse Tspan-5,a member of the tetraspanin superfamily,is highly expressed in brain cortical structures.Neuroreport,2000,11:3181-3185.
12 Garcia-Frigola C,Burgaya F,de Lecea L,et al.Pattern of expression of the tetraspanin Tspan-5 during brain development in the mouse.Mech Dev,2001,106:207-212.
13 Juenger H,Holst MI,Duffe K,et al.Tetraspanin-5 (Tm4sf9) mRNA Expression Parallels Neuronal Maturation in the Cerebellum of Normal and L7En-2 Transgenic Mice.J Comp Neurol,2005,483:318-328.
14 Tohami T,Drucker L,Shapiro H,et al.Overexpression of tetraspanins affects multiple yeloma cell survival and invasive potential.FASEB J,2007,21:691-699.
15 耿焱.四分子交联体5与大肠癌转移的关系.广州:南方医科大学,2008:69-74.
16 Iwai K,Ishii M,Ohshima S,et al.Expression and function of transmembrane-4 superfamily (tetraspanin) proteins in osteoclasts:reciprocal roles of Tspan-5 and NET-6 during osteoclastogenesis.Allergol Int,2007,56:457-463.
17 Koopman LA，Kopcow HD，Rybalov B，et al.Human decidual natural killer cells are a unique NK cell subset with immunomodulatory potential.J Exp Med,2003,198:1201-1212.
18 高天旸,余艳红.四分子交联体家族成员9 在滋养细胞中的表达及其意义.南方医科大学学报,2008,28:1080-1082.
19 高天旸,余艳红.RNA干扰技术抑制TM4SF9基因的表达对绒毛膜癌细胞生物学行为的影响.中华妇产科杂志,2008,43:460-462.
20 Kashef J,Diana T,Oelgeschlager M,et al.Expression of the tetraspanin family members Tspan3,Tspan4,Tspan5 and Tspan7 during Xenopus laevis embryonic development.Gene Expr Patterns,2013,13:1-11.
21 Bassani S,Cingolani LA.Tetraspanins:Interactions and interplay with integrins.Int J BiochemCell Biol,2012,44:703-708.
22 Zhang XA,Bontrager AL,Hemler ME.Transmembrane -4 superfamily proteins associate with activated protein kinase C (PKC) and link PKC to specific beta (1) integrins.J Biol Chem,2001,276:25005-25013.
23 Sjöqvist M,Antfolk D,Ferraris S,et al.PKCζ regulates Notch receptor routing and activity in a Notch signaling-dependent manner.Cell Res,2014,24:433-450.
24 Dunn CD,Sulis ML,Ferrando AA,et al.A conserved tetraspanin subfamily promotes Notch signaling in Caenorhabditis elegans and in human cells.Proc Natl Acad Sci USA,2010,107:5907-5912.
25 Haining EJ,Yang J,Bailey RL,et al.The TspanC8 subgroup of tetraspanins interacts with A disintegrin and metalloprotease 10 (ADAM10) and regulates its maturation and cell surface expression.J Biol Chem,2012,287:39753-39765.
26 Dornier E,Coumailleau F,Ottavi JF,et al.TspanC8 tetraspanins regulate ADAM10/Kuzbanian trafficking and promote Notch activation in flies and mammals.J Cell Biol,2012,199:481-496.
