产前诊断染色体疾病是降低胎儿出生缺陷率、提高人口素质的重要措施之一。研究表明，13、18、21三体及X、Y染色体异常所引起疾病约占新生儿染色体疾病的85%～90%[1]。细胞培养与染色体核型分析一直被视为诊断染色体疾病的“金标准”，但细胞培养时间长，染色体核型分析费时耗力，效率低下。荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)是将荧光素标记的探针与变性后经固定染色体、细胞、组织中核酸根据碱基互补原则进行杂交，洗涤后直接检测，或通过免疫荧光系统检测，具有简单、直观、安全、快速、灵敏度高等特点[2]。本文通过对比研究荧光原位杂交与染色体核型分析的检测结果，评价比较两种检测方法在产前染色体异常筛检中的应用价值。
对象与方法
1.临床资料：选择2011年5月—2014年9月来本院产科门诊进行产前诊断的孕妇444例为研究对象，纳入标准为(1)具有明显的羊水穿刺指征；(2)孕16～20周脐静脉穿刺或羊水穿刺检查；(3)母血清生化筛查阳性的染色体异常高危人群；(4)夫妻有一方染色体结构异常，且曾生育过染色体异常儿；(5)本次研究报请医院伦理委员会批准，且所有受试对象均签署知情同意书。其中184例脐血，260例羊水，孕妇年龄22～44岁，平均(28.3±3.4)岁，孕周17～24周，平均(20.1±2.3)周。所有孕妇均同时做荧光原位杂交与染色体核型分析。
2.标本采集：超声引导下经羊膜腔穿刺取羊水或脐血25 ml，分注入2支无菌玻璃试管中保存，一支15 ml，用于羊水细胞培养，一支10 ml，用于荧光原位杂交，所有羊水或脐血样本肝素抗凝后及时送检。
3.羊水培养及染色体核型分析：参照产前诊断技术行业标准与规范[3]，将15 ml试管于2 500 rpm/min离心分离10 min后弃去上清液，取沉渣制成细胞悬液，接种于羊水细胞培养基中，存于37 ℃培养箱中培养，于第6天换液时观察细胞生长情况。当细胞生长良好常规制片，G带显色，观察15～20个细胞分裂相，分析5个核型，若疑为异常核型，则计数不低于50个分裂相。
4.荧光染色体原位杂交：采用北京金菩嘉公司生产FISH探针，探针一组为GLP13(绿色)/GLP21(红色)；探针二组为CSP18(蓝色)/ CSPX(绿色)/ CSPY(红色)。(1)取10 ml玻璃试管于2 500 rpm/min离心分离10 min后弃上清液，胶原酶B消化，加入5 ml氯化钾(KCl)溶液做低渗处理，预固定去上清液制成细胞悬液，滴片并风干老化；(2)玻片预处理。老化玻片冷却后，采用胃蛋白酶工作液浸泡10 min，2次SSC溶液漂洗，梯度脱水，自然干燥玻片；(3)变性杂交。将10μl探针混合液滴于玻片杂交区域，回盖玻片，75 ℃变性5 min，于42 ℃杂交16 h；(4)洗涤复染。玻片用SSC漂洗，70%乙醇脱水3 min，避光风干，采用15μlDAPI复染剂复染，盖上盖玻片后，10～20 min后观察结果；(5)结果判读。随机计数50个羊水细胞进行判断，正常为超过90%细胞显示正常信号(GLP13/GLP21组：21号为2个红色荧光点，13号为2个绿色荧光点；CSP18/CSPX/CSPY组：18号为2个天蓝色荧光点，X显示2个绿色荧光点则提示女性，X显示1个绿色荧光点，Y显示1个红色荧光点，提示为男性)；异常为超过60%细胞出现异常信号；无法判读为扩大计数至100个细胞确定最后结果[4]。
5.统计学处理：采用SPSS 16.0 软件进行统计分析，计量资料用
表示，采用t检验，检测结果用频数(n)表示，检出率、灵敏度、特异度、准确度、阳性预测值、阴性预测值等用率(%)表示，采用卡方检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。
结果
1.染色体核型与荧光原位杂交检测结果：444例患者中，染色体核型分析平均报告时间(22.5±3.4)d，分析成功率97.3%(432/444)；荧光原位杂交平均报告时间(3.1±0.3)d，分析成功率100%(444/444)。荧光原位杂交平均报告时间明显低于染色体核型分析平均报告时间，差异有统计学意义。
444例患者中，染色体核型分析检出异常染色体28例，染色体异常率6.3%(28/444)，其中184例脐血中，数目异常8例，结构异常3例；260例羊水中，数目异常12例，结构异常5例。荧光杂交检出异常染色体26例，染色体异常率5.9%(26/444)，其中184例脐血中，数目异常6例，漏检1例，结构异常3例；260例羊水中，检出数目异常11例，漏检1例，结构异常5例。染色体核型分析与荧光原位杂交两种检出率比较差异无统计学意义。不同类型染色体异常检出结果，见表1。
表1 染色体核型分析与荧光原位杂交结果(例)
2.荧光原位杂交与染色体核型分析检测结果比较：28例染色体异常患者中，染色体核型分析检出13、18、21、X、Y非整倍体20例，荧光原位杂交检出18例，漏检或误检2例(18-三体嵌合体)，荧光原位杂交检测灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为90.0%(18/20)、100.0%(424/424)、100.0%(424/424)、99.5%(424/426)；对于全部染色体，荧光原位杂交检出26例，漏检或误检2例(嵌合体1例，平衡异位1例)，荧光原位杂交检测灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为92.9%(26/28)、100.0%(416/416)、100.0%(416/416)、99.5%(416/418)。见表2。
表2 荧光原位杂交与染色体核型分析检测结果比较(例)
讨论
产前诊断是提高人口素质的主要方法之一，羊水细胞染色体核型分析是目前产前诊断中应用最多且比较稳定可靠的检测方法，也是产前诊断的“金标准[5]”。缺点在于受体外培养时间与培养条件限制，存在羊水细胞培养时间长、失败率高、效率偏低、标本用量大等缺点[6]。研究表明，利用13、21染色体特异序列探针与18、X、Y染色体着丝粒α卫星探针对羊水细胞13、18、21、X、Y染色体进行检测，其敏感性与特异性分别为83.0%～100.0%与99.8%～100.0%[7]，而且可以明显降低受试者等待过程中的焦虑情绪。2004年英国国家筛检委员会(UK National Screening Committee,UKNSC)推荐，对于唐氏综合征产前检查高风险或高龄、且超声显示胎儿结构正常孕妇，建议采用荧光原位杂交为首的快速诊断检测方法[8]。
目前国内也有用于常见非整倍体异常诊断的商品化探针，荧光原位杂交应用于临床产前诊断比较普遍[9]。石鑫玮等[10]报道53例患者荧光原位杂交检测与染色体核型分析一致率达到100%，且平均报告时间无低于染色体核分析平均报告时间。本研究中，采用染色体核型分析检出28例染色体异常患者，荧光原位杂交检出26例染色体异常患者，符合率92.9%。其中，染色体核型分析检出13、18、21、X、Y非整倍体20例，荧光原位杂交检出18例，漏检或误检2例，符合率90.0%(18/20)。漏诊2例18-三体嵌合体患者，结果均为正常男性胎儿，可能是胎儿Y染色体产生异位，导致荧光原位杂交多检测出一个Y信号。提示荧光原位杂交法不可以独立应用于13、18、21、X、Y非整倍体的检测诊断中，国内外学者文献报道也均支持这一观点[11-12]。
进一步分析荧光原位杂交与染色体核型对于全部染色体的检测结果，染色体核型检出的28例异常患者中，荧光原位杂交检出26例，漏检或误检2例，分别为平衡异位1例，染色体倒位1例，检测灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为92.9%、100.0%、100.0%、99.5%，与潘小平等[13]文献报道基本一致。提示荧光原位杂交检测方法的局限性，特别是对于染色体结构异常、染色体倒置、基因移位染色体结构异常者[14]。间期荧光原位杂交法是一种靶向检测技术，受限于探针数量与种类，在目标范围内表现出较好的灵敏度与特异度，但不能对全部23对染色体数目与结构进行检查[15]，因此Lupski等[16]建议采取联合检测的方法。
本研究结果表明，荧光原位杂交检测具有直观、安全、快速、灵敏度高等特点，但受到探针与种类的限制，还无法替代染色体核型分析，特别是对于有多项特征异常患者应同时进行染色体核型分析和荧光原位杂交检测。
参考文献
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