随着全球经济的发展，肥胖不只是发达国家普遍存在的现象，现已成为一个世界性的问题，并且逐步向儿童、青少年蔓延。儿童、青少年期正是身体发育的时期，肥胖严重影响儿童的生长发育，引起成年2型糖尿病和心血管疾病的发生，并与癌症、抑郁症等疾病的发生相关[1]。近年来，儿童肥胖呈上升趋势。肥胖是环境因素和遗传因素共同作用的结果。国内外的研究表明，测量肥胖相关指标体重指数(BMI)具有很高的遗传度，并且与人群年龄密切相关，其中以儿童青少年人群的BMI遗传度最高[2]。神经生长调节蛋白1(neuronal growth regulator 1,NEGR1)是近10年来发现的与BMI相关的因子。NEGR1广泛分布于下丘脑和皮下脂肪，是体脂分布调控网络的枢纽，国内有关NEGR1基因多态性与壮族儿童单纯性肥胖的相关性鲜有报道。近期，全基因组关联分析(GWAS)研究发现肥胖及BMI与NEGR1 基因rs3101336多态性有关联[3]。本研究拟采用一种基于单碱基延伸原理的快速、简便、高通量的SNP分型方法(SNaPshot技术)对NEGR1 基因rs3101336 位点进行基因分型，分析其与广西壮族男性儿童单纯性肥胖的关系，旨在探讨广西壮族肥胖儿童中的相关遗传因素。
材料与方法
1.一般资料：2012年1月—2013年12月来柳州市妇幼保健院就诊的3～18岁无血缘关系壮族肥胖男童93例作为肥胖组，健康对照组63例均随机选自本院健康体检标准体重的儿童中无血缘关系的同年龄段个体。儿童单纯性肥胖症组根据中国肥胖问题工作组推荐的标准进行诊断入组[4]。两组均排除继发性肥胖症且未服用激素与影响脂代谢的药物。
2.血糖及血脂4项测定：两组儿童于相同条件下按照标准方法测量身高和体重，根据公式BMI=体重(kg)/身高(m)2计算体重指数。所有受检对象均于当天空腹抽取肘静脉血 3 ml,枸椽酸钠抗凝。应用美国罗氏公司MODULAR PS00全自动生化分析仪，以酶法测定血清总胆固醇(TC)、 三酰甘油(TG)、 高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的水平。使用仪器配套试剂，严格按操作规程进行操作，试剂均在有效期内使用。同时严格执行室内质控程序。抽取静脉血2 ml，不抗凝，应用葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖，使用的仪器为日立7600。
3.基因组DNA 提取：取200 μL EDTA-Na2 抗凝血，用Qiagen试剂盒提取全血基因组DNA。
4.NEGR1基因多态性的检测：(1)引物。用软件Primer Premier 5进行引物设计。PCR扩增正向引物(F)的序列为CCACGTAAAAGCCTGTCAGA，反向引物(R)的序列为TGACCAGGGATGGAGCTATG。SNaPshot反应过程中延伸引物序列为ttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttAAGAAAGCAATGACTGAACTTAG。(2)扩增。 PCR反应总体积为20 μL，包括10×PCR buffer(invitrogen公司)2 μL，dNTP混合物0.5 μL(10 mM，Takara公司)，0.8 μL MgCl2(50 mM，invitrogen公司)，Platinum Taq DNA聚合酶0.5 μL (invitrogen公司)，PCR正向和反向引物(10 pmol/L)各0.5 μL，DNA模板(20 mg/L)1 μL。PCR反应程序为95℃预变性2 min，95℃变性20 s，56℃退火30 s，72℃延伸40 s，循环33次，最后72℃延伸5 min。PCR扩增后，取PCR反应产物2 μL做琼脂糖凝胶电泳检测有片段的表明实验成功。(3)纯化。总体积为10 μL，在2 μL PCR产物中加入0.3 μL SAP(1U/μL)和0.2 μL Exo I(20 U/μL)，震荡混匀，37℃孵育1 h 40 min，然后75℃灭活SAP和Exo I酶15 min。(4)SNaPshot反应。 取1.5 μL纯化产物，每条浓度为0.2 μmol/L的SnaPshot引物混合物、SNaPshot荧光混合物(含AmpliTaqDNA多聚酶和不同荧光标记的ddNTP)组成一个PCR反应体系。SNaPshot反应程序为96℃变性10 s，51℃退火5 s，60℃延伸30 s，25个循环，最后60℃延伸30 s。SNaPshot PCR产物用SAP纯化，总体积为8 μL，在5 μL上述延伸产物中加入0.5 μL SAP(1U/μL)，震荡混匀，37℃保温1 h，75℃灭活SAP酶15 min。(5)3730扫板分析。取1μL每份样品，加入Hi-Di Formamide(高纯甲酰胺)8.5 μL和GeneScan-120 LIZ Size Standard 0.9 μL，总体积10 μL，95℃变性5 min，迅速冰冷4 min。在ABI3730XL型DNA序列检测仪上进行电泳分离，GeneMapper 4.0软件分析结果。
5.统计学处理：采用SPSS 13.0进行统计学处理，计量资料采用均数±标准差，组间差异进行方差分析，样本间率的比较用χ2 检验，P<0.05 为差异有统计学意义。
结果
1.一般资料、血糖及血脂4项的分析结果：两组间年龄差异无统计学意义，身高差异有统计学意义，见表1。
表1 肥胖组与对照组的年龄、身高和BMI
注：两组比较，*P <0.05
肥胖组儿童的TG和LDL-C的相对于对照组升高，HDL-C则低于对照组，见表2。
表2 肥胖组与对照组的血糖及血脂四项的结果(mmol/L)
注：两组比较，*P<0.05
2.NEGR1 基因rs3101336 位点多态性的分析结果：3730测序结果经GeneMapper4.0软件处理后NEGR1 基因rs3101336 位点的SNaPshot图像见图1。
A：NEGR1 基因rs3101336 位点T/T基因型 B：NEGR1 基因rs3101336 位点T/C基因型 C：NEGR1 基因rs3101336 位点C/C基因型
图1 NEGR1 基因rs3101336 多态性位点的峰型和基因型
3.两组NEGR1 基因rs3101336 位点基因型及等位基因型频率比较：NEGR1 基因rs3101336 (T/C)位点CC、CT、TT基因型在对照组和肥胖组频率分别为93.7%、6.3%、0和81.7%、18.3%、0，两组等位基因频率分别为96.8%、3.2%和90.9%、9.1%，见表3，经Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验，其等位基因在两种人群中的分布符合遗传平衡，具有群体代表性。肥胖组的BMI水平为(28.1±4.3)kg/m2显著高于健康对照组的(19.0±2.5)kg/m2。T等位基因的OR值为3.1，95%的可信区间为1.0～9.3。该位点各基因及基因型频率在广西壮族学龄前肥胖儿童与健康对照组中分布的差异有统计学意义，说明该位点为广西柳州壮族学龄前肥胖儿童的易感位点。
表3 肥胖组和对照组NEGR1基因rs3101336位点基因型和等位基因频率 [例(%)]
注：两组比较，*P<0.05
讨论
肥胖既是独立疾病，又作为明确的危险因素与众多慢性疾病的发生与死亡紧密相关。低龄化肥胖潜在危害比肥胖本身要大，肥胖与体脂平衡和能量代谢调节的关系密切。研究表明肥胖在男性儿童中的发生率高于女性[5]，考虑到性别之间可能存在差异，本研究以男性肥胖儿童为研究对象。通过比较肥胖组和对照组的血糖和血脂结果发现，肥胖早期血糖、TC、TG、LDL-C的水平仍在正常范围，但高于对照组，而HDL-C则低于对照组。吴双胜等[6]研究表明肥胖儿童中发生代谢综合征的比例明显高于正常体重儿童，从本研究的结果可以推断体内的血糖及脂肪的代谢在肥胖的早期就开始变化，说明肥胖与体内代谢紊乱密切相关，可见肥胖不仅是代谢综合征之源，也是糖尿病、心血管疾病等慢性疾病的源头之一。因此，揭开肥胖的发生机制，研究不同阶段促成儿童肥胖的各种相关因素是防止肥胖发生的关键，同时也可预防其所导致相关疾病的发生。
肥胖是由遗传因素和环境因素等多种因素共同作用的结果，遗传因素在个体肥胖的发生和发展中起到重要作用。神经生长调节蛋白1(NEGR1)是神经突触分泌的一种神经递质，表达于下丘脑和皮下脂肪，参与体脂平衡和能量代谢的调节，是调节人体脂肪分布的枢纽。该基因位于1号染色体短臂，由7个外显子和6个内含子组成，研究表明，NEGR1基因座位周围的序列发生43kb和8kb缺失与早期肥胖的发生相关，这可能与其5’端转录因子结合元件丢失有关，rs3101336位于43kb的缺失范围内[3]，近年来国内外开展了一些NEGR1基因及NEGR1 rs3101336多态性位点和肥胖关系的研究。Hester等[7]研究发现rs3101336与非洲裔美国人的BMI密切相关，rs3101336多态性与中枢神经对体重的调控有关，这一结论与NEGR1作为神经递质相符。学者Cheung等[8]研究发现，NEGR1 rs3101336多态性位点可能参与中国汉族成年人群的肥胖发生。本研究以壮族肥胖儿童为研究对象来阐述NEGR1 rs3101336多态性与男性儿童肥胖的关系，结合文献说明，NEGR1 rs3101336多态性可能与不同种族及年龄段的肥胖发生有关，该位点与女性肥胖是否存在相关性目前不明确，有待进一步研究。
NEGR1大量表达于中枢神经系统中，研究表明NEGR1在中枢神经系统中发挥作用进而影响食物摄入，诱导肥胖的发生和进展；通过小鼠模型表明，NEGR1基因被敲除或突变后，小鼠的体重显著下降，进一步研究发现，NEGR1缺陷的小鼠活动明显减少，进食量也大大减少[9]，这一发现证实了NEGR1基因与肥胖的发生和发展有关。Gamero-Villarroel等[10]研究表明NEGR1基因同样可以影响人的活动减少，体温降低，进食量减少。Hester等[7]研究表明NEGR1基因上游与肥胖相关的SNP位点rs3101336、rs2568958 和 rs2815752与西方儿童青少年的肥胖有关联性，Wang等[3]研究中国人群的肥胖与rs2815752无关联，而与rs3101336关联有显著性。本研究表明rs3101336与中国壮族肥胖儿童的肥胖也有关联，该位点对我国其他少数民族肥胖的遗传效应有待研究。rs3101336与肥胖的关联性在多个种族及不同年龄段人群中均得到验证，说明其可能存在较大的遗传效应，进一步扩大样本研究或开展相关的机制研究对于肥胖遗传因素的阐明具有重要的意义。
参考文献
1 张亚茹，杨琍琦.儿童肥胖症的相关研究进展.医学综述,2015,21:475-477.
2 Min J,Chiu DT,Wang Y.Variation in the heritability of body mass index based on diverse twin studies:a systematic review.Obes Rev,2013,14:871-882.
3 Wang J,Mei H,Chen W,et al.Study of eight GWAS-identified common variants for association with obesity-related indices in Chinese children at puberty.Int J Obes (Lond),2012,36:542-547.
4 中国肥胖问题工作组，季成叶.中国学龄儿童青少年超重、肥胖筛查体重指数值分类标准.中华流行病学杂志,2004:10-15.
5 Kanter R,Caballero B.Global gender disparities in obesity:a review.Adv Nutr,2012,3:491-498.
6 吴双胜,王海俊,马军.儿童肥胖与代谢综合征关系的研究进展.中国生育健康杂志,2008,19:179-182.
7 Hester JM,Wing MR,Li J,et al.Implication of European-derived adiposity loci in African Americans.Int J Obes (Lond),2012,36:465-473.
8 Cheung CY,Tso AW,Cheung BM,et al.Obesity susceptibility genetic variants identified from recent genome-wide association studies:implications in a chinese population.J Clin Endocrinol Metab,2010,95:1395-1403.
9 Lee AW,Hengstler H,Schwald K,et al.Functional inactivation of the genome-wide association study obesity gene neuronal growth regulator 1 in mice causes a body mass phenotype.PLoS One,2012,7:e41537.
10 Gamero-Villarroel C,González LM,Gordillo I,et al.Impact of NEGR1 genetic variability on psychological traits of patients with eating disorders.Pharmacogenomics J,2015,3:278-283.