微小RNA(microRNA，miRNA)是一类内源性的保守的小分子单链RNA，能够与其下游靶基因的3'-非编码区碱基不完全或完全配对，促进下游靶mRNA的降解和(或)抑制翻译过程而在转录后水平上发挥负调控作用。基质金属蛋白酶-9(MMP-9)作为miR-199a-5p的间接作用靶点参与异位内膜细胞的侵袭、种植等作用[1]。已有研究发现，miR-199a-5p在子宫内膜异位症(edommometriosis，EMS)患者血清中表达减少[2]，而MMP-9在EMS患者血清中表达增多[3]。关于miR-199a-5p与MMP-9在EMS患者血清中的变化的相关性未见报道。本研究分别采用实时荧光定量PCR及ELISA法分别检测EMS组患者与对照组患者血清中miR-199a-5p和MMP-9的差异表达，分析二者与子宫内膜异位症临床特征的关系及两者之间的相关性，并探讨其调控EMS发生发展可能的机制，为内异症的临床诊断及治疗提供新的依据。
对象与方法
一、对象
收集2013年9月—2014年9月在本院就诊、行手术治疗且术后病理学证实为卵巢子宫内膜异位症患者40例(其中12例合并盆腔腹膜异位病灶)(EMS组)；同期因不孕症行腹腔镜检查，诊断为输卵管积水患者(排除内异症、子宫腺肌病)20例(对照组)。两组均处于卵泡期、术前3个月未使用过激素类药物及抗生素治疗，月经规律，无高血压、糖尿病及多囊卵巢综合征等代谢和内分泌疾病。两组年龄、体重指数比较，差异均无统计学意义，见表1。EMS组按美国生育协会修正(r-AFS)分期轻度(Ⅰ—Ⅱ期)8例，重度(Ⅲ—Ⅳ期)32例；视觉模拟评分法(VAS评分)对痛经量化，轻度(≤4分)20例，重度(>5分)20例。两组均于术前晨抽空腹静脉血，分离出血清后于-80 ℃冰箱保存待用。本研究经本院伦理委员会通过，患者知情同意并签字。
表1 两组年龄和体重指数比较
二、方法
1.试剂：miRcutemiRNA提取分离试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司；TransScript miRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒、TransScript Top Green qPCR SuperMix试剂盒，购自北京全式金生物技术有限公司；引物由大连宝生物公司设计并合成；人基质金属蛋白酶-9ELISA试剂盒，购自上海西唐生物科技有限公司。
2.实时荧光定量PCR法检测血清miRNA相对表达量：(1)血清中miRNA富集部分的提取使用miRcute miRNA提取分离试剂盒[离心柱型]按说明书提取血清中miRNA。(2)miRNA的cDNA合成使用TransScript miRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒。反应体系为20 μl，包括miRNA 6 μl，TansScript miRNA RT Enzyme Mix 1 μl，2×TS miRNA Reaction Mix 10 μl，RNase-free water 3 μl。反应条件为37 ℃孵育60 min，85 ℃、5 s失活miRNA RT Enzyme Mix。(3)miRNA的荧光定量PCR检测采用TransScript Top Green qPCR SuperMix试剂盒[SYBR]。重复3孔，采用25 μl反应体系，包括Template(cDNA) 2 μl，Forward Primer (表2)1 μl，Reverse Primer(为试剂盒提供的通用引物)1 μl，2×TransStart Top Green qPCR Super Mix 12.5 μl，Passive Reference Dye 0.5 μl，ddH2O 8 μl。反应条件：采用两步法，94 ℃反应30 s使起始模板变性；94 ℃反应5 s使PCR循环中的模板变性；60 ℃反应30 s进行退火及延伸；反应进行45个循环。
表2 miRNA及内参基因的引物序列
3.ELISA法：检测血清MMP-9的浓度(ng/ml)。
4.表达水平：检测miRNA的相对表达水平，以miR-16为内参基因[4]，对目标基因进行归一化处理。血清中miRNA的相对表达量计算公式如下：RQ=2-△Ct[5]。检测血清MMP-9浓度，使用Microplate Manager 5.2软件，输入标准品各浓度值，绘制出标准曲线，得出MMP-9含量，再乘以稀释倍数。
5.统计学处理：使用SPSS 17.0统计学软件。正态分布计量资料采以均数±标准差表示，采用两独立样本t检验；非正态分布计量资料以中位数(四分位数)表示，采用两独立样本Mann Whitney U秩和检验。相关性分析采用Spearman相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。
结 果
一、PCR特异性分析
对miR-199a-5p和内参基因miR-16的熔解曲线进行分析，每条曲线在Tm值最高时仅有一个峰(图1)，表明不存在引物二聚体或其他非特异性扩增产物出现。
图1 miR-199a-5p和miR-16的溶解曲线
二、两组血清中miR-199a-5p和MMP-9的表达
两组血清中均检测出miR-199a-5p和MMP-9的表达，EMS组血清中miRNA-199a-5p表达少于对照组，MMP-9含量高于对照组，差异均有统计学意义，见表3、图2。
表3 两组血清中miR-199a-5p和MMP-9比较
注：两组比较，*P<0.05
图2 两组血清中miRNA-199a-5p及MMP-9的表达水平比较
三、EMS组血清miR-199a-5p、MMP-9的表达与临床特征的相关性
EMS组血清miR-199a-5p相对表达量随r-AFS分期增加而减少，MMP-9表达量随r-AFS分期增加而增加，差异均有统计学意义；EMS组血清中miR-199a-5p和MMP-9的表达量与VAS评分无关，见表4。
四、EMS组血清miR-199a-5p与MMP-9的相关性
EMS组血清中miR-199a-5p相对表达量与MMP-9呈负相关(r=-0.501)。
表4 EMS组血清miR-199a-5p、MMP-9含量与临床特征的关系
注：与重度比较，*P<0.05
讨 论
子宫内膜异位症的发病机制众说纷纭，至今不清。近些年来国内郎景和院士等人提出了“在位内膜决定论”[6]，即在内异症病灶形成过程中，在位内膜的生物学特性(黏附、侵袭、血管形成等)是造成内异症发生、发展的决定性因素。miRNA的作用类似于抑癌基因和癌基因的功能。子宫内膜异位症虽为良性病变，却有着类似恶性肿瘤的行为。新近研究[7-8]发现，异常的miRNAs表达可能参与到内异症的发生、发展。
已有研究表明，miR-199a-5p在内异症病灶中的表达水平显著降低[1]。miR-199a-5p在子宫内膜异位症患者血清中的异常表达变化趋势不同[2,8]，提示其可能在内异症的形成过程中起到一定的调节作用。本研究发现，子宫内膜异位症患者血清中miR-199a-5p表达减少，同时，血清中miR-199a-5p的表达随内异症r-AFS期别的增加而逐渐减少，说明miR-199a-5p参与内异症的发病并与病情的发展有关，可以作为检测病情的临床指标。同时，本实验还发现，内异症患者血清中miR-199a-5p的变化与疼痛评分无关，内异症疼痛产生的主要原因为异位病灶神经的浸润、局部炎症的反应等，进一步说明疼痛与疾病的严重程度无关。
MMP-9是基质金属蛋白酶家族中分子量最大的明胶酶，能降解细胞外基质(ECM)中Ⅲ、Ⅳ型胶原和明胶，并能通过与整合素α3β1的相互活化而促进ECM的重塑[9]，也可促进血管内皮细胞的生长，新生血管生成[10]。本研究显示，EMS组血清中MMP-9表达量明显高于对照组，且Ⅲ—IV期MMP-9浓度也明显高于I—Ⅱ期，说明MMP-9与EMS发病成正相关，且与病情的严重程度有关，与邱晓红等[11]研究一致。子宫内膜细胞逆流至腹腔，由于MMP-9的过表达而降解局部ECM，使其能够穿透其周围的基底膜，侵袭腹膜及周围结缔组织，并得以种植、生长。
Dai等[1]研究发现，IKKβ为miR-199a的靶基因。IKKβmRNA的3′-UTR区存在miR-199a的直接结合位点，miR-199a通过与之结合，在转录后水平调节IKKβ的表达，抑制NF-κB通路的活化水平，进而抑制MMP-9靶基因的表达[12]，人子宫内膜间质细胞的黏附、迁移和侵袭能力减弱。本研究证实，EMS组miR-199a表达与MMP-9表达呈负相关，低表达的miR-199a可能通过增强NF-κB的活化，进而增加MMP-9的表达，促进子宫内膜在子宫腔以外的增殖、黏附、转移及血管形成等，参与EMS的分子发病机制。
总之，内异症患者血清中的miR-199a-5p和MMP-9表达异常与内异症r-AFS分期有关，miR-199a-5p可能通过MMP-9参与内异症的发生及疾病的进展，为进一步阐明EMS可能的发生发展、侵袭的分子机制及临床诊断和靶向治疗提供新的依据。
参考文献
1 Dai L,Gu L,Di W.miR-199a attenuates endometrial stromal cell invasiveness through su-ppression of the IKKbeta/NF-kappaB pathway and reduced interleukin-8 expression.Molecular Human Reproduction,2012,18:136-145.
2 Chia-Yi Hsu,Tsung-Hua Hsieh,Cheng-Fang Tsai,et al.miRNA-199a-5p regulates VEGFA in endometrial mesenchymal stem cells and contributes to the pathogenesis of endometriosis.J Pathol,2014,232:330-343.
3 Collette T,Bellehumeur C,Kats R.Evidence for an increased release of proteolytic activity by the eutopic endometrial tissue in women with endometriosis and for involvement of matrix metalloproteinase-9.Hum Reprod,2004,19:1257-1264.
4 Jia SZ,Yang Y,Lang J,et al.Plasma miR-17-5p,miR-20a and miR-22 are down-regulated in women with endometriosis.Hum Reprod,2013,28:322-330.
5 Livak KJ,Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta DeltaC(T))Method.Methods,2001,25:402-408.
6 朗景和.子宫内膜异位症发病的“在位内膜决定论”.第八次全国妇产科学学术会议论文汇编,2004.
7 Ohlsson Teague EM,Van der Hoek,Van der Hoek MB,et al.MicroRNA-regulated pathways associated with endometriosis.Mol Endocrinol,2009,23:265-275.
8 Wang WT,Zhao YN,Han BW,et al.Circulating micmRNAs identified in a genome-wide serum micmRNA expression analysis as noninvasive biomarkers for endometriosis.J clin Endocrinol Metab,2013,98:281-289.
9 Missan DS,Mitchell K,Subbaram S,et al.Integrin α3β1 Signaling through MEK/ERK Determines Alternative Polyadenylation of the MMP-9 mRNA Transcript in Immortalized Mouse Keratinocytes.PLoS One,2015,10:e0119539.
10 Ria R,Loverro G,Vacca A,et al.Angiogenesis extent and expression of matrix metalloproteinase-2 and -9 agree with progression of ovarian endometriomas.Eur J Clin Invest,2002,32:199-206.
11 邱晓红，韩丽英，李荷莲，等.子宫内膜异位症患者血清和腹腔液中明胶酶活性测定及其临床意义.中国实用妇科与产科杂志,2002,22:191-193.
12 Zhang H,Li M,Wang F,et al.Endometriotic epithelial cells induce MMPs expression in endometrial stromal cells via an NFkappaB-dependent pathway.Gynecol Endocrinol,2010,26:456-467.