胚胎停育是指孕早期胚胎由于某种原因停止发育导致胚胎死亡，最终表现为流产的一种病理性妊娠［1］。胚胎停育多发生于孕早期，随着我国生育年龄整体推迟，生活方式和环境污染加剧，其发病率有上升趋势，约为13.4‰［2］。胚胎停育影响妇女身心健康、生殖健康、人口可持续发展。随着医疗检测技术的发展，优生优育观念的加强，发生胚胎停育的妇女在临床上被发现的越来越早。胚胎停育一旦发生，不仅给妊娠妇女造成身心影响，而且给孕妇家庭带来沉重的心理负担，甚至会影响下次妊娠。
目前，针对导致胚胎停育发病原因的研究较多，部分胚胎停育的发生可能与孕期妇女叶酸水平相关。本文希望通过分析叶酸代谢相关基因位点多态性与胚胎停育之间相关性，为临床干预及诊断提供分子医学的理论依据。
对象与方法
一、对象
2012年3月—2016年1月在山东淄博临淄区妇幼保健院就诊被确认为胚胎停育的484例汉族女性作为病例组，平均年龄(30.0±5.2)岁，所有患者均经B超及血hCG确诊。对照组为本院选取的与其年龄、民族、检测时期相匹配的已经怀孕的836例女性，平均年龄(30.6±6.1)岁，入组受检者之间无血缘关系。病例组及对照组入组标准为:(1)均为排除严重的器质性病变与子宫附件疾病的健康女性;(2)均获得研究对象知情同意。
二、方法
1.样本采集:本研究样本均采用中国疾病预防控制中心妇幼保健中心指定采样拭刮取口腔脱落黏膜细胞，采用柱式抽提试剂盒抽提样本DNA，试剂盒购自上海生工生物公司，统一送至中心实验室进行分析。
2.基因检测:用 Taqman-MGB技术，使用Taqman-MGB探针的 Realtime PCR反应，检测MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G的基因多态性。检测过程中所使用的仪器和试剂均购买自美国ABI公司。该反应所使用的仪器为ABI7900HT荧光定量 PCR，将 DNA 模板(20 ng/μL，1μL)、探针(20×Taqman-MGB，具体信息见表1)及引物(2×Taqman Universal Master Mix 5μL)投入仪器，每个反应体系总体积10μL。设定反应温度95℃，反应10 min后，92℃变性 15 s，60℃退火 1 min，循环 20个扩增;之后改变条件，89℃反应15 s，60℃退火1.5 min，循环30次。最后，在PCR仪上读取反应终点，并利用分析软件确定基因分型结果。
表1 Taqman-MGB探针所在位置
3.统计学处理:采用SPSS18.0软件进行统计学分析，Hardy-Weinberg遗传平衡检验采用χ2检验，病例组和对照组叶酸代谢障碍关键酶MTHFR(C677T、A1298C两个位点)和MTRR(A66G位点)基因多态性及频率分布的差异比较采用卡方检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。
结 果
Hardy-Weinberg遗传平衡检验可知，病例组MTHFR基因 C677T位点 P=0.73，A1298C位点P=0.33，MTRR基因 A66G位点 P=0.11;对照组MTHFR基因 C677T位点 P=0.46，A1298C位点P=0.95，MTRR基因 A66G位点 P=0.21，均 P＞0.05，说明该组样本可代表临淄地区女性遗传特点，依据该样本得出的分析结果是可靠的。
一、病例组和对照组MTHFR C677T基因型和等位基因分布
病例组发生胚胎停育女性的MTHFR C677T野生基因型 CC型58例(12.0%)，杂合突变 CT型224例(46.3%)，纯合突变TT型202例(41.7%)，而对照组相应数据为 102例(12.2%)，366例(43.8%)，368例(44.0%)，两组差异无统计学意义。
病例组中C、T的频率分别为35.1%、64.9%，对照组C、T的频率分别为34.1%、65.9%，两组差异无统计学意义。
见表2。
表2 MTHFR C677T基因型及等位基因分布情况［例(%)］
二、病例组和对照组MTHFR A1298C基因型和等位基因分布
病例组MTHFR A1298C位点野生基因型AA型362例(74.8%)，杂合突变116例(24.0%)，纯合突变6例(1.2%)。对照组AA型642例(76.8%)，杂合突变AC型181例(21.7%)，纯合突变型13例(1.6%)，两组差异无统计学意义。
病例组中A、C的频率分别为86.8%、13.2%，对照组分别为87.6%、12.4%，两组差异无统计学意义。
见表3。
表3 MTHFR A1298C基因型及等位基因分布情况［例(%)］
三、病例组和对照组MTRR A66G基因型和等位基因分布
病例组MTRR A66G位点野生基因型AA型299例(61.8%)，杂合突变155例(32.0%)，纯合突变30例(6.2%)。对照组中 AA型495例(61.8%)，杂合突变AG型288例(34.4%)，纯合突变型53例(6.3%)，等位基因 G的频率分别为22.2%和23.6%，两组差异无统计学意义。见表4。
表4 MTRR A66G基因型及等位基因分布情况［例(%)］
讨 论
引起胚胎停育的原因很多，主要有感染因素、遗传因素、内分泌因素、环境因素、物理化学因素、免疫和营养等因素［3］，部分胚胎停育的发生与男性有关［4］。
叶酸参与核酸、氨基酸、蛋白质和磷脂代谢，与细胞分化、倍增及其功能密切相关。妊娠早期缺乏叶酸，可导致受精卵着床、细胞分化受阻、胎盘滋养层发育障碍，进而发生胚胎发育迟缓、胚胎停育、流产、胎儿神经管缺陷、早产等。此前有报道提示，叶酸缺乏可能是导致胚胎停育的一个重要原因。北京市海淀区妇幼保健院顾依群等［5］的研究表明妊娠早期缺乏叶酸可导致胚胎停育发生。河北省计划生育研究所张桂英等［6］研究显示胚胎停育妇女血叶酸水平显著低于对照组。
5，10-亚 甲 基 四 氢 叶 酸 还 原 酶 (5，10 Methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)和甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)的基因多态性是引发Hcy代谢异常的重要因素［7］，从分子机制上来讲，编码叶酸代谢过程中关键酶基因发生突变，导致HCY升高，可能影响胚胎在体内的发育，从而引起胚胎停育。
由于MTHFR和MTRR的基因多态性在各民族和地域之间存在差异［8-9］，因此，各地区研究结果不尽相同。本研究尝试通过分析山东临淄地区胚胎停育妇女和正常妇女的叶酸代谢障碍关键酶基因多态性对胚胎停育造成的影响，探讨两者之间的相关性。
秦奇等［10］的研究认为 MTHFR、MTRR 基因多态性可能是导致胚胎停育的一个原因，其中MTHFR C677T、MTRR A66G两位点突变易造成胚胎停育，未发现MTHFR A1298C位点单基因突变与胚停相关，但MTHFR C677T、A1298C协同突变则有可能导致胚胎停育发生。蔡丽梅等［11］仅分析MTHFR基因多态性，胚停组TT基因型和T等位基因所占比例明显高于对照组。而本研究中并未观察到上述结论，可能原因有以下几点:(1)导致胚胎停育的原因较多，叶酸营养只是其中一个方面;(2)叶酸代谢障碍(MTHFR 677TT基因型)在我国汉族人群的分布南北极不均衡，总体特征北高南低，大致来说，MTHFRC677T基因型在中国北方和南方的比例相差27%左右［12-13］。淄博地区的调查数据［14］显示，MTHFR C677T位点TT基因型所占比例高达43.6%，大大高于全国平均水平;(3)环境因素亦是导致胚胎停育的一个重要原因［15］，淄博市属于传统化工企业集中的城市，而临淄区化工企业量、化工企业密度、数量均居全国首位［16］。化工产业对当地居民的生活环境(空气、土壤和水质)有不良影响，可能增加胚胎停育发生的风险。
针对胚胎停育发生原因的研究较多，除了遗传、内分泌、感染、免疫等常见因素，越来越多的研究倾向于环境因素及环境和遗传因素之间的相互作用，但仍然有一部分不明原因的胚胎停育需要后续大量的研究去证实。本研究试图通过分析山东临淄地区怀孕女性的叶酸代谢相关基因位点多态性，探讨基因多态性与胚胎停育之间的关系，扩充该领域的病因学研究。遗传多态性由于种族、民族、地区的不同而呈现出各自的特点，临淄地区本身高风险人群比例较高，且环境污染因素较为突出，导致遗传因素的影响程度相对较低，因此本研究在组间比较并未观察到差异。本研究并未针对妊娠结局进行追踪，比较个体化干预对于妊娠结局的影响。因此，叶酸代谢相关基因位点多态性是否为胚胎停育的风险因素有待进一步讨论。
参考文献
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