先天性心脏病(congenital heart diseases，CHD)是胎儿时期心脏血管发育异常所致的心血管畸形，表现为心脏及大血管的形成障碍而引起的局部解剖结构异常，或出生后应自动关闭的通道未能闭合［1］。CHD分为单纯性和综合征性，单纯性 CHD只有心脏畸形的表型可通过手术纠正，而综合征性CHD常合并心外表现，预后差异较大。22q11微缺失综合征是导致CHD常见的综合征之一，预后不良，常合并严重的心外症状，如胸腺、甲状旁腺发育不良、细胞免疫异常、生长发育与智力发育迟缓等［2］。本文对柳州市妇幼保健院1例CHD胎儿及其父母亲的临床资料进行回顾性分析。
对象与方法
1.研究对象:孕妇，汉族，24岁，孕1产0，2次不良孕产史，妊娠16+6周，产前筛查神经管缺陷风险值1/349，超声检查发现胎儿心脏缺陷包括室间隔缺损(ventricular septal defect，VSD)、主动脉骑跨(dextropositioned aorta，DA)、肺动脉狭窄(pulmonic stenosis，PS)，至本院遗传咨询。夫妻双方健康，非近亲结婚。为明确病因，知情选择后，进行了羊水穿刺术和胎儿及胎儿双亲常规染色体G显带核型分析，未见异常，进一步通过MLPA DiGeorge试剂盒及基因芯片检测发现22q11.21微缺失。夫妇最终选择终止妊娠，引产后尸检发现胎儿患有室间隔缺损、主动脉骑跨、肺动脉狭窄。
2.基因组DNA提取保存:B超定位行羊膜腔穿刺抽取羊水30 ml，20 ml羊水用于细胞培养行染色体核型分析，10 ml羊水用于 DNA提取检测。用标准酚氯仿提取基因组DNA，TE溶液洗脱，分光光度计下测定DNA浓度及纯度，保持DNA A260/280 nm在1.7～1.9范围内。
3.MLPA分析:采用荷兰 MRC公司研发的SALSA MLPA P250 B2 DiGeorge试剂盒，共49条探针，1条探针位于22q11.1区域内，20条探针位于22q11.21区域内，5条探针位于22q11.22区域内，3条探针位于 22q11.23区域内，2条探针位于22q13.33区域内，2条探针位于04q35区域内，3条探针位于08p23.1区域内，2条探针位于09q34.3区域内，5条探针位于10p14区域内，1条探针位于10p12.31，4条探针位于17p13.3区域内。
4.SNP-array分析:芯片检测样本按试剂盒操作手册提取基因组DNA(DNA浓度≥50 ng/"l，纯度OD:260/280在 1.8～2.0间)。SNP-array采用 Human CytoSNP-12芯片试剂盒(Illumina公司)。芯片经过洗涤和离心甩干处理后，扫描和分析结果。芯片结果经数据库查询、比对后根据其临床意义分为致病性(Pathogenic)、良性(Benign)、临床意义不明确(VOUS)3类。本实验室所采用的数据库为实验室内部数据库，DGV数据库(The Database of Genomic Variant)，DECIPHER数据库(The Database of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans usingensemble Resources)，OMIM 数据库(Online Mendelian Inheritancein Man)，ISCA 数 据 库 (International Standardfor Cytogenomic Arrays Consortium)等。
结果
1.MLPA检测结果:与22q11.2微缺失综合征相关的14个探针对应的片段大小位置在MLPA检测的峰值相比健康对照明显出现减半，见图1，统计缺失区比值为0.5～0.56(正常值:0.7～1.3)，MLPA探针检测信号在0.7～1.3之间为正常，小于0.7为缺失，大于1.3为拷贝数增加。胎儿父母亲与22q11.2微缺失综合征相关的14个探针对应的片段大小位置峰值相均在正常范围，见表1。可判断胎儿在与22q11.2微缺失综合征相关的14个基因位点上存在杂合性缺失。
图1 胎儿羊水脱落细胞MLPA检测结果
表1 胎儿及其父母亲22q11.2区带MLPA检测结果
2.SNP-array检测结果:SNP-Array分析，在胎儿22q11.21区发现存在2.57 Mb的致病性缺失片段，位于18889490-21460220区段，含66个基因，其中包括心脏发育相关的重要基因TBX1;其他染色体未见拷贝数变异，见图2。
讨论
CHD为胚胎时期心血管发育异常所致的心脏血管形态、结构、功能、代谢的异常，是人类最常见的出生缺陷之一。在活产儿中的患病率为25.1/10 000，在死产或流产病例中的发病率更高，约为1/100［3］。CHD可以以单一症状出现(单纯性先心病)，也可以合并其他症状一起出现(如18-三体、22q11综合征等)，大部分单纯性CHD患儿出生后可以通过手术治愈，而非单纯性CHD常合并其他症状，这一类患儿的心脏畸形可以通过手术治愈，但心外的症状严重影响患儿的生长发育及生活质量，因此防止严重的非单纯性CHD患儿出生意义重大。本文病例为16+6周的中孕胎儿，经超声发现心脏存在室间隔缺损、主动脉骑跨、肺动脉狭窄，未见明显的心外畸形，而其他生长发育的评估在胎儿期尚无法评估，进一步采用分子生物学技术分析发现该胎儿存在22q11微缺失的新发突变，父母均未见次突变。22q11微缺失综合征(degorge syndrome)也叫腭心面综合征(velocardiofacial syndrome，VCFS)，发病率为 1/4 000［4］。22q11微缺失综合征相关的临床表现存在较大的个体差异，主要包括先天性心脏病、特征性异常面容、胸腺发育不良所致的免疫缺陷、咽功能不全、低钙血症、发育与行为异常、成年期精神疾病等。22q11微缺失综合征是导致CHD和发育迟缓的第二大原因，也是导致综合征型腭异常的常见因素［5］。尽管在心脏手术治疗方面22q11微缺失综合征疗效尚可，但绝大部分患者存在从学习困难到智力障碍程度不等的认知缺陷，患儿后期的生活质量受到影响，给患者本人、家庭和社会带来了沉重的经济和心理负担。近年来，随着基因组学研究方法和技术的进步，与CHD相关的遗传变异逐渐被发现。对于这些由染色体异常及拷贝数变异(CNV)往往导致综合征型CHD，表现为心脏、血管的发育异常，甚至心外畸形及多种功能异常，可以采取产前分子遗传学诊断，从而可以预防这一类患儿的出生［6］。
人类22号染色体是一个近端着丝粒染色体，多个基因组病发生于22q11染色体区域，该区域富含具有高度同源性，导致基因组间出现重复序列(lowcopy repeats，LCRs)而易发生重组交换，其中22q11.1至22q11.3区间内LCR22-A至LCR22-H之间的重组与22q11微缺失的发生密切相关［7］。目前报道的22q11微缺失从0.7 Mb到3 Mb不等［6］，见图3。
图2 胎儿羊水脱落细胞基因芯片检测结果
图3 22q11相关微缺失的缺失范围
22q11微缺失为一类常染色体显性基因组病，单拷贝的缺失就可以导致疾病的发生。该病是导致广西地区CHD最常见的病因，93%为新发突变，7%来自父母的遗传。在22q11微缺失中，LCR22-A至LCR22-D之间发生交换产生的3 Mb缺失最为常见，占87%，近端1.5 Mb缺失由LCR22-A至LCR22-B之间发生交换，占8%，其余5%为不典型缺失［7］。研究表明，常见的3 Mb缺失(LCR22-A至LCR22-D之间交换)及1.5 Mb缺失(LCR22-A至LCR22-B之间交换)大多不是遗传自父母而是新生的变异，而中部LCR22B-LCR22D及LCR22C-LCR22D之间的交换产生的缺失常遗传自父母。遗传来源的22q11微缺失对认知的影响比新发的微缺失更显著，这可能是由遗传因素、社会经济及家庭因素共同作用的结果［6］。基于22q11.2中部缺失综合征遗传率较高，建议先证者的父母行缺失检测和遗传咨询。现有的研究表明22q11区带多个基因与22q11微缺失的症状密切相关［8］。TBX1基因是22q11区域的重要基因之一，常见的3 Mb和1.5 Mb缺失均引起为TBX1基因单拷贝缺失。TBX1基因是进化过程中高度保守的转录因子T-box家族成员之一，精细调控人体器官的发育。小鼠实验研究表明［9］，TBX1缺乏导致多种心血管发育异常，包括咽弓动脉发育和成形的异常，心脏外流出道发育和分离异常，室间隔缺损和圆锥动脉干不分离等。而且研究表明人体中TBX1基因的重复、缺失与点突变均与CHD患儿心脏异常密切相关。TBX1还参与调节口腔上皮细胞的黏附和腭部的发育，与Degorge综合征人群的腭裂、咽功能不全及低钙血症表型密切相关。该区域内还包括COMT、GNB1L及UFD1L等孤独症及精神分裂症相关的基因，这些基因在22q11微缺失综合征患者中表达水平下降，可能参与这些患者出现神经精神症状的发生［10］。本文发现胎儿携带22q11微缺失为不典型2.57 Mb缺失，为新发的变异，父母双方均未检出相同变异，该变异为LCR22-A至LCR22-D之间交换产生，缺失范围在常见的3 Mb内。
目前，临床对22q11微缺失综合征的诊断主要依据临床症状、体征、心脏彩色超声、胸部X线及心电图的结果。22q11微缺失综合征在胎儿期就有表现，研究表明90%左右的患病胎儿可发现心脏异常，86.1%存在胸腺发育异常，33.8%可发现尿道畸形，7% ～74%左右的胎儿表现出某些面容异常，如小嘴唇、鼻梁突出、缩颌、耳朵异常、宽颈、唇腭裂等，19.7%～37.1%可表现出不同类型的四肢异常，16.9%可以发现骨骼异常，15.4%存在可发现神经系统异常，12.1%的女性胎儿存在生殖器异常，5%的存在体重低于第5百分位数［11］。常规的方法有助于对已发生的心脏畸形和功能异常进行诊断，但无法对人群中CHD发生风险进行评估，而且在产前筛查与诊断中这些技术只能在形态方面提供诊断依据，对胎儿发育及认知的风险无法进行评估。采用现代分子诊断技术可对CHD胎儿及患者在分子水平上进行诊断，不仅有助于排查CHD的再发风险，而且可以对胎儿或患者后期的发育等其他方面的影响进行分析。本文在产前诊断的系统彩超中发现胎儿存在CHD，并进一步进行分子遗传学分析，确诊携带了22q11微缺失，告知其父母患儿出生后可能出现临床表型，由患儿父母选择是否引产。该病遗传咨询首先需要明确父母的基因型，如果父母未检出相同变异，则下一胎再发的风险小，但也高于普通人群，因为父母可能存在生殖细胞嵌合或者低比例的体细胞嵌合;如果先证者的22q11微缺失遗传来自父母一方，下一胎再发的风险为50%。同样先证者的后代也有50%的再发风险［12］。对于再生育的家庭，现代分子诊断技术有助于早发现，提醒家长应早期随访和及时干预，避免延迟诊断带来的风险。
参考文献
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