女性生殖器结核（FGTB）是危害妇女健康的常见生殖器官炎症，与输卵管性不孕及复发性流产相关，但其临床特征不明显，容易被误诊或忽视，目前尚无明确早期诊断FGTB的实验室指标［1］。近年来，荧光定量聚合酶链反应（PCR）技术已成为一项快速有效的病原学检测方法用于生殖器结核的诊断［2］。月经血是女性一项特殊检查标本，可以反映生殖器官的生理和病理变化，且取材无痛方便，国内还未见月经血检测用于FGTB诊断的报导，因此，对怀疑生殖器结核的不孕症及复发性流产患者进行月经血结核杆菌抗酸染色、培养及PCR检测，并与宫、腹腔镜检查结果相对照，现总结分析如下。
对象与方法
一、对象
2009年10月—2014年3月于本科诊治的不孕症及复发性流产患者共145例。输卵管性及不明原因不孕患者 87例，平均年龄（312±34）岁，平均不孕年限（36±24）年；原发不孕62例，继发不孕25例。复发性流产患者58例，均除外染色体异常，平均年龄（283±31）岁，平均流产次数（37±12）次。
二、方法
1研究方法：所有患者均行常规病因学检查，知情同意后行结核菌素PPD试验、月经血结核杆菌抗酸染色、培养及荧光定量PCR检测。不孕患者行宫、腹腔镜联合检查；复发性流产患者行宫腔镜检查，对术中可疑病灶、病变输卵管、子宫内膜送组织病理检查。
2PPD试验：于前臂掌侧皮内注射01 ml含1 U卡介菌纯蛋白衍生物，72 h观察结果。测量注射部位硬结的横径和垂直径，平均硬结直径＜5 mm为阴性，5～9 mm为弱阳性，10～19 mm为阳性，20 mm以上或有水泡、坏死、淋巴管炎者，均属于强阳性。
3月经血结核杆菌检测方法：患者月经来潮第1～3天，置阴道窥器，用1 ml注射器吸取月经血1～2 ml，进行抗酸染色、培养及荧光定量 PCR检测。荧光定量PCR检测方法：月经血与10 ml NH4Cl溶液混匀，静置30 min，2500转／分离心10 min，离心后取沉淀－20℃冷冻备用。取40μl沉淀加40μl DNA提取液，震荡吹打混匀，100℃水浴10 min，室温静置 1 h，13 000转／分离心 10 min，取上清液10μl加入反应体系，再按荧光定量PCR试剂盒常规操作，≥50 Copy即判断为阳性。PCR荧光检测试剂盒购自中山大学达安基因股份有限公司。
4腹腔镜及宫腔镜检查：常规术前检查无异常，于月经干净3～7天住院检查。腹腔镜下了解子宫、卵巢、输卵管、盆腔情况。典型盆腔结核表现为盆腔腹膜或脏器表面粟粒样结节、干酪样病变、盆腔广泛粘连钙化、输卵管增粗僵硬、瘘管形成，伴有腹水、包裹性积液。对可疑病灶取活检送病理检查，镜下典型表现及病理结合确诊盆腔结核。宫腔镜下内膜结核表现为内膜增生不均，灰白色或干酪状，血管丰富迂曲，严重者内膜薄，瘢痕化，宫腔粘连，可直视下取异常组织送病理检查，病理见典型的结核结节可诊断内膜结核［3］。
5统计学处理：采用SPSS 180统计学软件。计量资料以（珋x±s）表述，采用t检验；计数资料采用χ2检验。p＜005为差异有统计学意义。
结 果
一、宫、腹腔镜检查结果
输卵管性及不明原因不孕患者87例，腹腔镜临床及病理确诊生殖器结核16例，子宫内膜异位症3例，盆腔粘连53例，正常盆腔15例。复发性流产患者58例，宫腔镜病理确诊生殖器结核5例，慢性内膜炎29例，正常内膜14例。
二、PPD试验结果
21例生殖器结核患者中，PPD强阳性18例，124例非生殖器结核患者中强阳性1例。
三、月经血结核杆菌检测结果
所有送检标本结核杆菌抗酸染色和培养结果均为阴性。21例宫、腹腔镜病理确诊生殖器结核患者中，月经血结核杆菌荧光定量PCR检测阳性3例，阴性18例。124例非结核患者中，1例阳性。此法的灵敏度为 143%（3／21），特异度为 992%（123／124），见表 1。
表1 月经血结核杆菌荧光定量PCR检测结果（例）
讨 论
一、女性生殖器结核与不孕及复发性流产的关系
生殖器结核常发生于性成熟及生育期妇女，目前仍是发展中国家导致女性不孕的重要因素。结核杆菌感染生殖器官形成慢性炎症病变，输卵管最早被感染，其次为内膜组织，但大多数患者最初感染后并无明显临床症状，常被忽略和误诊，但随着疾病进展，经腹腔镜检查可发现不可逆的严重结核性输卵管和盆腔病变，影响生殖功能。因此需要有在输卵管性不孕和不明原因不孕患者中早期筛查结核感染的意识［4］。结核感染导致机体免疫反应增强，子宫内膜结核结节周围腺体对卵巢分泌甾体激素反应不良，分泌现象不足，从而影响胚胎种植和正常发育，而导致自然流产，所以在复发性流产患者筛查治疗结核感染也很重要［5］。
二、女性生殖器结核诊断方法
由于缺乏特异临床表现以及很难获取标本进行细菌病原学检测，在不孕妇女中诊断生殖器结核也是一项严峻的挑战［6］。目前没有一种方法可以完全诊断生殖器结核，需要结合病史、多种检查方法综合诊断［78］。可在不孕症及流产患者中开展生殖器结核高危患者初步筛查、病原学检查、手术病理学诊断阶梯式检查诊断流程。
首先对病史、基础体温（BBT）、B超、子宫输卵管造影（HSG）结果提示FGTB高危患者进行病原学检查。改良罗氏培养法、涂片抗酸染色镜检法等传统病原学诊断方法缺点是要求技术条件高，检测周期较长，临床已较少使用。
γ干扰素释放试验诊断结核杆菌感染灵敏度高，优点是可以避免卡介苗接种对试验结果的干扰，缺点是受体免疫状态的影响较大，技术要求高，费用高，不适合在基层医院推广［9］。噬菌体生物扩增法检测白带中的结核杆菌，也具有较高的敏感性和特异性［10］，但不适用于血性标本。PPD试验操作简单，强阳性提示机体处于超敏状态，可能存在活动性感染［11］。本研究21例 FGTB患者，PPD强阳性18例，124例非生殖器结核强阳性仅1例，有较高阳性率。
近年来分子生物学检测方法逐渐用于临床，PCR技术通过扩增结核杆菌DNA，已被证实可用于生殖器结核的快速诊断［12］，特别是荧光定量PCR技术是用荧光标记探针实现定量功能，结核分枝杆菌DNA的阳性率为6l%，特异度可达100%［13］。多项研究认为虽然较传统检测手段费用高，但荧光定量PCR技术优点是缩短诊断时间，提高了诊断效率，且还可用于子宫内膜、淋巴组织、体液、尿液、月经血、精液等多种标本的检测［14］，缺点是可能存在一定假阳性率。
对疑难病例可进行宫、腹腔镜手术检查，优点是术中可以直视下发现病变，镜下形态学观察诊断阳性率可达95%，结合定位活检可以获得明确组织学证据，缺点是手术费用较高，且为有创检查，不适合作为首选。组织病理学检查是诊断FGTB可靠的方法，但阳性率低，需结合宫腹腔镜形态学诊断。
总之，临床FGTB诊断方法有多种，因荧光定量PCR技术较为成熟，临床应用比较广泛，适用多种标本，可以快速提供检测结果，因此本文选择荧光定量PCR为研究方法，对女性月经血这个特殊标本进行检测，为不孕及流产患者提供了一种早期、简便、快捷、准确、无创的诊断手段。
三、月经血检测用于生殖器结核诊断的临床意义
月经血是子宫内膜周期性脱落和子宫内膜层血管的出血，可反映子宫内膜和输卵管生理和病理变化。利用月经血这个特殊标本，可进行生化指标和病原体检测，用于疾病病因学检查和诊断，并且取材方便无痛。较早Oosthuizen等［15］报道109例不孕症患者，取月经血、子宫内膜组织、腹水行培养、抗酸染色及组织学检查，结核杆菌培养共26份阳性标本，月经血占6916%，子宫内膜占17%，腹水占26%，认为经月经血结核杆菌培养阳性率高且无创。本研究中，月经血培养结核杆菌培养均阴性，可能与筛查人群及培养方法和培养条件不同有关。Narotam Sharma对子宫内膜活检组织、内膜诊刮组织、月经血、精液、胎盘、尿液多种标本进行PCR检测、培养及涂片，认为 PCR阳性率（307%）优于培养（81%）及涂片（19%）方法，在8份月经血标本中PCR阳性率 125%，而培养及涂片均无阳性［16］。本研究中月经血PCR检测的灵敏度143%，特异度992%，虽较传统诊断方法高，但还不足以用于生殖器结核的诊断，分析原因可能有月经血是血性标本，血红蛋白是Taq酶的抑制物，虽然在标本处理中有去除血红蛋白的步骤，但还是会造成阳性漏检，影响结果［17］；其次可能月经血中结核杆菌含量很低，或取材量少不能代表感染的范围，多次多量取标本用于检测或许会改善检测结果；另外病例数较少，可扩大标本量进一步研究，来判断月经血诊断的价值。
综上所述，在输卵管和不明原因不孕及复发性流产患者中早期筛查结核感染具有很重要临床意义，月经血结核杆菌PCR检测虽较传统检测方法灵敏度高，但能否用于生殖器结核的诊断还需进一步研究，应多部位取材、多种检测方法相结合来提高诊断效率，还需结合临床症状体征及其它辅助检查来综合诊断治疗女性生殖器结核。
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