宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率占女性恶性肿瘤的第2位，仅次于乳腺癌。在我国，每年约有13万新发病例，约占世界宫颈癌新发病例总数的28%[1]，且宫颈癌发病逐渐趋于年轻化。目前针对年轻的宫颈癌患者，在标准的手术治疗之后通常进行术后放疗。这种治疗策略，虽然能够提高治愈率，但放疗会严重损伤卵巢组织。卵巢是女性重要的生殖和内分泌器官，能够产生性激素及生成卵子，在调节激素代谢和内分泌中发挥重要作用。年轻女性失去卵巢功能，不仅会因性激素分泌下降出现围绝经期症状，且会影响全身脂肪、钙和磷代谢，导致心血管系统、神经系统、泌尿系统及基础代谢的异常[2]，严重影响患者的生活质量。因此，在进行放疗前行手术将卵巢取出后进行冷冻保存，待放疗结束后选择适当时机进行卵巢组织自体移植术，对保存和恢复患者的卵巢功能有很大的临床价值。本研究通过观察冷冻卵巢组织自体移植于患者前臂后对卵巢内分泌功能的影响，探讨冷冻保存卵巢组织移植术恢复卵巢内分泌功能的可行性，为人类卵巢组织冷冻移植研究提供依据。
对象与方法
1.对象：8例卵巢组织标本取自年轻宫颈癌患者手术切除的正常卵巢组织。患者年龄28～42岁，均未绝经。临床分期：Ⅰ b1期2例，Ⅰ b2期4例，Ⅱ a2期2例。病理诊断：1例Ⅱ a2期为宫颈腺癌，其他7例均为宫颈非角化型鳞状细胞癌。手术方式：患者均行经腹或腹腔镜下广泛全子宫切除术+单侧卵巢悬吊术+单侧卵巢组织冻存。术后病理结果报8例患者病变均累及宫颈深肌层，其中1例累及宫颈全层，2例发生淋巴结转移，全部病例术后仅接受放射治疗。8例患者随机分为两组，对照组(3例)和冻存卵巢组织移植组(5例)。实验获得深圳市人民医院伦理委员会同意，所有患者均签署知情同意书。
2.主要试剂及仪器设备：二甲基亚砜(DMSO)、人白蛋白(HSA)、蔗糖购自Sigma公司，TCM-199培养基购自Hyclone公司。CL-8800冷冻仪，澳大利亚Cryologic公司。Beckman Coulter UniCel DxI 800化学发光免疫分析系统。
3.慢速冷冻方法冷冻和解冻卵巢组织：将卵巢组织迅速置于预冷的TCM-199培养基中，置于冰壶内，在离体30分钟内转移至实验室。在无菌超净工作台内，用含青、链霉素的TCM-199培养基反复清洗2、3次，除去坏死组织及血迹。在×10体视显微镜下，用眼科镊、眼科剪去卵巢髓质，仅留下卵巢皮质，切割为1.0 cm×1.0 cm×1.0 mm大小的组织块。将卵巢组织块放入盛有1 ml冷冻液(含1.5 mol/L DMSO+0.1 mol/L蔗糖+5% HSA的TCM-199培养基)的冻存管中，4 ℃平衡30 min后放入程序冷冻仪中，从4 ℃开始以2 ℃/min的速度降至-7 ℃，渗透10 min后植冰，持续10 min，然后以0.3 ℃/min速度降至-40 ℃，再以10 ℃/min速度降至-140 ℃，保持10 min，投入液氮并放入液氮罐保存。每例患者保存卵巢组织片10片。
解冻时取出冻存管，空气中停留30 s后置于37 ℃水浴2～3 min，将卵巢组织置于含1.0 mol/L DMSO+0.1 mol/L蔗糖+1% HSA的TCM-199培养基中5 min，然后按浓度梯度依次洗脱冷冻保护剂：0.5 mol/L DMSO+0.1 mol/L蔗糖、0.25 mol/L DMSO+0.1 mol/L蔗糖和0.1 mol/L蔗糖各停留5 min。
4.冻存卵巢组织自体移植手术：移植组在完成放疗半年，除外病变复发后，将5～6片卵巢皮质组织扇形展开平铺包埋于血管较丰富的前臂肱桡肌筋膜下，缝合筋膜及皮肤。
5.性激素测定：采用Beckman Coulter UniCel DxI 800化学发光免疫分析系统进行性激素的测定。对照组为完成放射治疗后半年为时间起点，在此后的1个月、3个月、6个月、9个月及12个月进行检测；卵巢冻存移植组在完成放射治疗后半年进行卵巢冻存组织移植，移植术后1个月、3个月、6个月、9个月及12个月分别进行性激素及卵巢移植部位彩超检查。
结果
1.卵巢内分泌激素水平：对照组3例在术后的放疗及随访过程中均出现不同程度的围绝经期症状和卵巢内分泌功能异常。在术后3个月时E2分泌水平显著降低，FSH和LH也呈现高值水平，随访1年期间激素水平无改善。其中1例患者术后9个月出现E2明显下降<20 pg/ml，FSH显著升高>40 U/L，LH显著升高>50 U/L，提示其卵巢功能衰竭(表1)。冻存卵巢组织移植5例在放疗结束后行前臂冻存卵巢组织自体移植术，在移植后6个月后出现了卵巢内分泌功能的逐渐恢复。其中3例术后9个月E2分泌水平恢复正常，FSH和LH分泌量显著降低，但1例术后1年失随访(表2)。
表1对照组患者术前、术后性激素水平情况
表2冻存卵巢组织自体移植术患者术前、术后性激素水平情况
2.移植部位卵巢超声结果：冻存卵巢组织移植5例患者术后1个月移植部位卵巢大小、形态正常，内部有少量及点状血流信号。术后6个月，移植部位卵巢内部可见血流信号和小卵泡发育，但是卵巢组织体积较前均出现缩小，其中2例缩小明显(表3)。
表3冻存卵巢组织移植术后移植部位超声检查结果
讨论
随着宫颈癌筛查体系的逐步完善及诊治水平的不断提高，宫颈癌患者5年生存率已显著提高。临床上，针对年轻的宫颈癌患者，通常在标准的手术治疗之后行辅助性放疗和(或)化疗。放化疗在极大程度缓解癌症病情的基础上，却对卵巢组织造成了严重的不可逆转的损伤，导致卵巢早衰，使得年轻女性患者在获得长期存活的同时，也失去了卵巢内分泌功能及生育能力。近年来，随着冷冻保存技术、血管吻合技术和辅助生殖技术的发展，冻存卵巢组织移植技术已成为解决年轻宫颈癌患者卵巢早衰、保存和恢复生殖内分泌功能的有效选择[3]。目前冻存卵巢组织的移植主要包括异位移植和原位移植两种。异位移植是将卵巢的皮质片移植到皮下，例如前臂和腹壁。原位移植通常是将卵巢的皮质片移植到保留的卵巢、卵巢韧带或是卵巢窝附近[4-5]。Okaty等[6]为1例35岁III B期宫颈癌患者行前臂皮下冻存卵巢移植，术后18个月每个月都有优势卵泡发育，并经皮吸收能够获得成熟的卵母细胞。Radwan等[7]报道一位28岁宫颈浸润性腺癌患者行广泛子宫切除术，并将每个卵巢切取一半进行冷冻保存。在术后行辅助性放疗，患者出现典型的围绝经期症状，E2分泌量为2 pg/ml，FSH分泌量为96.25 U/ml，LH分泌量为37.55 U/ml。随后将冻融的卵巢组织自体移植到前腹壁，9周后卵巢内分泌功能开始逐渐恢复，24周后卵巢内分泌功能恢复到正常水平。多个团队也报道了冻存卵巢组织自体移植后可恢复和维持卵巢功能，能够获得成熟卵母细胞，并成功生产新生儿[8-11]。
目前卵巢组织冷冻技术可根据冻存速度的不同分为快速冻存和慢速冻存两种。慢速冻存，即程序化法(conventional freezing)，需要通过程序冷冻仪实现逐步地、程序化地降温直至进入液氮。快速冻存，即玻璃化法(vitrification)，是一种把卵巢组织直接投入液氮的方法，它利用高浓度的冷冻保护剂所产生的玻璃态或无定形态在冷冻过程中可避免冰晶形成。这两种方法均可用于卵巢组织的冷冻保存，慢速冻存作为一种常规方法被普遍采用，保存效果稳定。玻璃化冻存是一个新的、不成熟的技术,也是当前的一个研究热点，但其对冷冻保护剂的要求高，目前没有统一的操作规程，而且存在解冻后的卵巢组织被液氮中微生物污染的潜在危险，安全性不如慢速法。在冷冻保护剂选择方面，二甲基亚砜和丙二醇被认为是冷冻卵巢组织效果最好的[12]。
本研究中8例宫颈癌患者行广泛全子宫切除术后均需行辅助性放疗，在手术同时行单侧卵巢悬吊术和单侧卵巢组织冻存。其中3例患者未进行卵巢组织移植，在术后3个月E2分泌水平显著降低，FSH和LH也呈现高值水平。其中1例患者术后9个月出现E2明显下降<20 pg/ml，FSH显著升高>40 U/ml，LH显著升高>50 U/L，提示其卵巢功能衰竭；另外2例患者在随访1年内卵巢内分泌功能逐渐降低，提示其卵巢功能受损。卵巢对放射性即为敏感，育龄期妇女盆腔放射剂量为单次4Gy或10天内照射总剂量15Gy，绝经前妇女5～10Gy便可导致卵巢功能受损甚至衰竭[13]。Toman等[14]测量了不同位点的卵巢接受盆腔外照射时射线剂量及对其功能的损伤程度的关系，指出只有放射野边缘2.5 cm以外的区域是相对安全区域，建议至少将卵巢移植于髂前上棘之上3.5 cm。但也有报道指出由于放射线的散射作用，约有总剂量的5%可散射到放射野外4 cm范围内[15]。本研究中3例行单侧卵巢悬吊术的患者将卵巢移植于髂前上棘之上3～3.5 cm皮下，在术后随访过程中均出现了不同程度的性激素释放异常和围绝经期症状，提示单纯的卵巢悬吊术式虽然能够保留卵巢功能，但仍不能完全避免放疗对卵巢组织的损伤，仍有一定的概率出现卵巢早衰。
本研究中另外5例患者在放疗结束后选择适当时机行冻存卵巢组织前臂自体移植术。在移植后6个月出现了卵巢内分泌功能的恢复，其中2例患者术后1年与未行卵巢移植的对照组性激素释放水平相当，并未恢复正常水平。另外3例患者术后9个月E2分泌水平恢复正常，FSH和LH分泌量显著降低；更有1例28岁的年轻患者在术后9个月性激素的释放恢复到与广泛全子宫清除术前相当的水平，已连续出现2次雌激素的明显升高，但1年后失随访。5例患者移植术后1个月移植部位卵巢大小、形态正常，内部有少量及点状血流信号。术后6个月，移植部位卵巢内部可见血流信号和小卵泡发育，但是卵巢组织体积较前均出现缩小，其中2例患者缩小明显。卵巢组织冻存移植后功能的恢复已经得到国内外研究的广泛证实，但是长期维持是目前此项技术研究的难点和焦点。目前关于移植后卵巢功能维持时间的长短报道不一，且多为个例报道。Baird等[16-17]对羊冻存卵巢组织移植后卵泡存活和发育情况进行长期观察发现，卵巢内分泌功能维持了近1年。Oktay等[18]将卵巢组织移植到前臂皮下，2例患者卵巢功能分别维持了21个月和超过2年。本研究虽然样本量较小，但是仍为需术后放疗的年轻宫颈癌患者卵巢移植术式的选择提供了依据。在提高生存率的同时，行单侧卵巢悬吊术合并单侧卵巢冷冻保存，待辅助性放疗结束后选择适当时机行冻存卵巢组织自体移植术，能够最大限度地保留卵巢正常功能，提高患者术后生活质量。
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