近年来，中国多次爆发大面积的雾霾事件，我国许多省份雾霾天气频发。颗粒物污染与雾霾天气的形成密切相关。高浓度的细颗粒物(空气动力学直径小于或等于2.5μm 的颗粒物，简称PM2.5) 是主要的污染物，同时也是大气环境中危害最大的污染物之一[1,2]。PM2.5由于其表面积大，易携带大量有毒有害物质经呼吸道进入人体肺部深处及血液循环，被认为相对于大的颗粒物来说对人体产生的危害更大[3,4]。PM2.5不仅对呼吸系统、心血管系统等产生不良影响，对妊娠及后代的影响也受到国内外关注。已有流行病学研究发现，孕期过量PM2.5 暴露是诸多不良妊娠结局，包括流产、死产、胎儿宫内发育迟缓、低出生体重、早产、出生缺陷等的重要危险因素[5-7]。动物研究也观察到了PM2.5对后代体重、胚胎发育的不利影响[8-10]。PM2.5对机体细胞的主要毒性机制之一涉及氧化损伤，因此我们推测，抗氧化活性物质可能对于PM2.5的毒性具有一定的拮抗作用。维生素 C(Vitamin C，VC)是一种在临床上广泛应用的抗氧化剂，研究[11]表明，VC可以清除胞内外自由基，有助于体内氧化还原系统的稳定。槲皮素(quercetin)是植物界分布最广的黄酮类化合物，广泛存在于水果、蔬菜以及一些中草药中，是人类饮食中最主要的生物类黄酮，研究[12]表明，槲皮素可有效清除自由基，抑制ROS生成酶，并预防氧化应激诱导的神经元损伤。
目前国内外的研究中，流行病学调查多为PM2.5对妊娠结局的影响，动物实验集中于PM2.5对胎鼠的影响，而缺少对后代长期影响的研究，更无膳食干预方面的研究。本研究建立不同剂量PM2.5染毒的动物模型，研究孕期及哺乳期PM2.5暴露对子代小鼠生长发育的影响，并选择VC、槲皮素两种抗氧化活性物质，探索其对PM2.5的这一发育毒性是否具有改善作用，为PM2.5对人类的发育毒性提供膳食干预思路。
材料与方法
一、材料
1. PM2.5采集和制备：采用TH-150C型号智能中流量(TSP)采样器(天虹智能仪器表厂，武汉)进行PM2.5采集，采样时间为2016年9月15日—2016年11月14日，采样地点为北京大学医学部公共卫生学院六层平台，采样仪器距离地面15米，采样流量设置为0.1 m3/min，颗粒物采集于石英滤膜上，每天采集22 h。石英滤膜在采样前和采样后分别恒温干燥24 h，称重，4℃避光保存。用灭菌手术剪将载有颗粒物的石英滤膜剪成1 cm × 4 cm大小后放入洁净烧杯中，加入超纯水，并用保鲜膜封口。水浴超声震荡20分钟，加冰保持水温在20 ℃以下，重复三次，收集洗脱液，并用6层灭菌纱布过滤。真空冷冻干燥后，用无菌PBS配制成不同浓度贮备液，-20℃避光保存。空白对照组的滴注液直接用干净的滤膜进行上述洗脱操作。
2.实验动物与分组：健康成年SPF级雌性ICR小鼠，体重(30±2)g，由北京大学医学部实验动物中心提供[SCXK(京)2015-0015]。动物饲养在屏障环境，温度控制在(22±2)℃，相对湿度50%～60%，昼夜照明时间为12 h:12 h。实验期间动物自由饮水和进食。动物适应性喂养1 周后，按体重随机分为6组：空白对照组(A)，PM2.5低、中、高剂量组(B、C、D)，VC干预组和槲皮素干预组(E、F)，每组12只。
二、方法
1. 实验操作：雌鼠随机分组后，每天晚上18:00将雌鼠与健康性成熟雄鼠1∶1合笼，第2天早上7:00分笼并检查阴栓，见栓即认为受孕，当天定为孕期第0天( gestational day 0，GD 0)。已确定怀孕的雌鼠单笼饲养，并饲喂繁殖期饲料，每天观察孕鼠有无嗜睡、烦躁、行动不便、阴道流血等异常情况出现。
(1)PM2.5染毒：各组母代小鼠分别于GD3、GD6、GD9、GD12、GD15和哺乳期第5天(lactation day5, LD5)、LD10和LD15日上午，在3%异氟烷短效气体麻醉下进行气管滴注，空白对照组给予1 ml/kg干净石英滤膜洗脱液滴注，其余各组按照1 ml/kg的体积滴注PM2.5溶液，PM2.5低、中、高剂量组分别给予3.75、7.5、15 mg/kg PM2.5溶液，VC和槲皮素干预组给予15 mg/kg PM2.5溶液。
(2)灌胃：母代小鼠在孕期和哺乳期每日灌胃。空白对照组和PM2.5低、中、高剂量组给予0.15%羧甲基纤维素钠水溶液灌胃，VC和槲皮素干预组分别给予100 mg/kg VC或槲皮素灌胃，VC和槲皮素均以0.15% 羧甲基纤维素钠溶液作为分散系。
2. 动物体重及进食量监测：每周监测母鼠孕期体重变化值和饲料消耗量，计算食物利用率，母鼠孕期体重变化值(g)=母鼠临产前体重(g)-母鼠受孕当天体重(g)；母鼠孕期食物利用率(×10-2)=母鼠孕期体重变化值(g)/ 母鼠孕期摄食量(g)。各组孕鼠自然分娩，记录分娩情况，称量仔鼠体重，计算母鼠孕期净增重，母鼠孕期净增重(g)=母鼠孕期体重变化值(g)-仔鼠总体重(g)。子代小鼠出生当天记为出生后第0天(postnatal day 0, PND0)，于出生后第4天调整窝大小，每窝保留6只子代小鼠，雌雄各半。哺乳期间，每周分别以窝为单位记录雌性、雄性子代小鼠体重，子代小鼠断乳后，雌雄分笼饲养，每周记录雌性和雄性子代小鼠的体重、饲料消耗量，并计算食物利用率。
3. 子代生理发育和神经反射指标监测[13, 14]：母代小鼠分娩后，每天观察所有子代仔鼠，记录每窝仔鼠生理发育指标(耳廓分离、门齿萌出、睁眼、睾丸下降和阴道开放)和神经反射指标(平面翻正、空中翻正、悬崖躲避和负向地性)达标的时间。将整窝仔鼠全部完成该生理指标发育的时间确定为该指标达标时间。所有指标均按照统一标准由固定人员观察。
4. 统计学分析：实验结果以
±s)表示。所有数据均采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)。方差分析的结果显示方差齐时采用LSD法进行两两比较；方差不齐时采用Tamhane’s T2检验法进行两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。
结 果
一、分娩情况及孕期母代小鼠体重和食物利用率
如表1所示，各组活产只数、母鼠孕期净增重、进食量及食物利用率均无显著差异(P> 0.05)，每只孕鼠约产12～13只活胎。
表1分娩情况及孕期母代小鼠体重和食物利用率
Table 1 Food intake, utilization, and weight gain of maternal mice during pregnancy and the number of births by groups
二、子代小鼠体重变化及食物利用率
子代小鼠体重变化见图1-a、1-b。出生后第14天，与空白对照组相比，PM2.5高剂量组子代雄性、雌性小鼠平均体重均有不同程度的降低，差异有统计学意义。出生后第4周，与空白对照组相比，PM2.5高剂量组子代雄性小鼠平均体重显著降低(P<0.05)。与PM2.5高剂量组相比，VC干预组雌性小鼠平均体重高于PM2.5高剂量组，差异有统计学意义，与空白对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。子代小鼠断乳后食物利用率见图2-a、2-b，各组动物食物利用率均无明显差异(P>0.05)。
三、子代小鼠生理发育指标
子代雄性、雌性小鼠生理发育指标达标时间见表2。子代雄性小鼠生理发育指标监测结果与空白对照组相比，PM2.5中、高剂量组门齿萌出(下)和PM2.5高剂量组睾丸下降达标时间明显延迟(P<0.05)。与PM2.5高剂量组相比，槲皮素干预组门齿萌出(下)达标时间有明显改善(P<0.05)，与空白对照组相比差异无统计学意义。子代雌性小鼠生理发育指标监测结果与空白对照组相比，PM2.5低、中、高剂量组门齿萌出(上)达标时间明显延迟(P<0.01)，PM2.5中、高剂量组门齿萌出(下)达标时间有不同程度的延迟(P<0.05)。
四、子代小鼠神经反射指标
子代雄性、雌性小鼠神经反射指标达标时间见表3。子代雄性小鼠神经反射指标监测结果与空白对照组相比，PM2.5高剂量组平面翻正、负向地性、悬崖回避达标时间明显延迟(P<0.05)，PM2.5中剂量组悬崖回避达标时间明显延迟(P<0.05)。与PM2.5高剂量组相比，VC干预组和槲皮素干预组平面翻正、悬崖回避达标时间均有明显改善(P<0.05)。子代雌性小鼠神经反射指标监测结果与空白对照组相比，PM2.5高剂量组负向地性、悬崖回避、空中翻正达标时间有不同程度的明显延迟(P<0.05)，PM2.5中剂量组悬崖回避达标时间明显延迟(P<0.01)。与PM2.5高剂量组相比，VC干预组悬崖回避、空中翻正达标时间均有明显改善(P<0.01)，槲皮素干预组悬崖回避、空中翻正达标时间均有明显改善(P<0.05)。
表2子代雄性、雌性小鼠生理发育指标达标时间
Table 2 Target time of physiology development in male and female offspring
Note：*P<0.05，vs. A；**P<0.01，vs. A；△P<0.05，vs. D.
表3子代雄性、雌性小鼠神经反射指标达标时间
Table 3 Target time of neural reflex in male and female offspring
Note：*P<0.05，vs. A；**P<0.01，vs. A；△P<0.05，vs. D；△△P<0.01，vs. D.
讨 论
多哈学说(Developmental Origins of Health and Disease，DOHaD)强调了孕期宫内环境对于胎儿长期甚至多代健康的影响[15]，孕期颗粒物暴露的影响可以通过宫内坏境和胎盘功能的改变传递给胎儿[16]，同时颗粒物中的有些成分可以透过胎盘屏障[17]，影响胎儿的生长发育。
PM2.5的化学成分对毒性有显著影响，已有研究[18]表明，与本研究同一地区收集的PM2.5富含O，Si，C，Fe，Ca，Mg，Al，K等。本研究所用PM2.5制备和染毒方法已在多项研究[8, 19]中被使用，可用来建立PM2.5染毒动物模型。本研究结果显示，孕期暴露一定剂量PM2.5对子代小鼠体重、生长发育指标和神经反射指标产生不良影响，PM2.5与不良影响间未发现严格的剂量反应关系，但结果显示PM2.5低、中、高剂量组与空白对照组相比，有统计学差异的指标依次增多，提示随着PM2.5剂量升高，其对子代的生长发育影响亦增大。
PM2.5高剂量组出生后第14天及第4周体重下降，提示孕期和哺乳期暴露一定剂量的PM2.5影响子代小鼠的生理发育。Hougaard[20]等研究产前暴露于柴油机尾气颗粒的子代小鼠发现，暴露组子代小鼠PND9～PND22体重增加显著降低，与本研究吻合。Hougaard[20]等推测这种长期影响可能是由于潜在暴露如污染物通过乳汁传递给胎儿、污染物沉积于胎盘缓慢释放给胎儿等原因导致，本实验用到的大气PM2.5样品在中国北方大城市非采暖期采集，机动车尾气是组成此时期大气PM2.5的主要成分之一[21]，故此研究有一定的参考意义，但PM2.5是否可以通过乳汁和胎盘尚需更多实验证据支持。
PM2.5的毒性与其复杂的成分密切相关，PM2.5主要由无机成分、有机成分和无机碳等组成，重金属是其重要的组成部分，容易对人体产生不良影响。吕京等[22]的研究显示，宫内铅暴露引起子代大鼠门齿萌出指标发育迟缓。刘继文等[23]研究表明母代大鼠孕前8周低铅染毒至断乳，子代大鼠门齿萌出率明显低于对照组(P<0.05)。王双青等[24]研究了50对孕妇—新生儿，发现市区PM2.5浓度明显高于郊区(P<0.01)，市区新生儿血铅水平明显高于郊区(P<0.05)，大气PM2.5 浓度对新生儿生长发育具有抑制作用，推测孕期暴露于高PM2.5浓度环境可能通过升高新生儿血中铅水平而抑制新生儿生长发育。本研究中雄性小鼠中、高剂量组门齿萌出(下)时间延缓，雌性小鼠低、中、高剂量组门齿萌出(上)时间延缓，中、高剂量组门齿萌出(下)时间延缓，推测PM2.5样品中来源于汽车尾气中的铅可能参与了这一作用，具体原因尚需进一步证实。
研究显示，PM2.5可携带多种环境毒物如微量元素和多环芳烃(PAHs)等，已有研究[25, 26]表明，在胎儿发育和产后早期暴露于环境毒物可导致雄性后代生殖功能障碍。本研究发现，孕期和哺乳期高剂量PM2.5暴露引起雄性后代睾丸下降延迟，PM2.5样品中携带的多环芳烃类物质可能参与了这一损伤作用的形成。
神经系统的发展是一个非常复杂的过程，受遗传因素和外部因素共同决定，脑结构和功能受损可能产生严重和长期的后果，可导致神经发育障碍(neurodevelopmental disorders，NDDs)。胎儿期是神经发育的重要时期，对不良宫内环境的影响非常敏感。已有资料[27-29]显示孕期暴露于空气污染影响子代神经发育，主要影响其行为和认知功能。而在本研究中发现，孕期和哺乳期暴露一定剂量的PM2.5暴露对后代神经反射发育的多个指标有所影响，提示PM2.5的神经发育毒性作用。
此外，实验结果显示，孕期和哺乳期PM2.5暴露对子代雄性、雌性在体重、门齿萌出、生殖器官发育、平面翻正、空中翻正等指标的影响不完全一致，提示PM2.5对子代的影响可能存在性别差异。许多研究[30-32]发现，空气污染对后代的影响与性别有关。这种差异可能是PM2.5中的内分泌干扰物与性激素相互作用的结果，其具体影响及产生差异的机制还需更深入的研究。
目前，PM2.5的发育毒性作用机制尚未阐明，氧化应激反应是研究最多的机制，VC和槲皮素是广泛存在于蔬菜水果中的抗氧化物质，我们的实验结果提示氧化损伤可能是PM2.5的毒性作用机制之一。冯金秋等[8]研究孕期每三天滴注15 mg/kg PM2.5的小鼠发现，母鼠血清中抗氧化活性物质含量下降，VC干预组和三个槲皮素干预组较PM2.5模型组有所改善，印证了这一推测。此外，有研究[33]显示，孕期暴露PM2.5使母代大鼠胎盘IL-6水平显著增高(P<0.01)，引起胎盘炎症，而槲皮素可以抑制炎症反应，下调IL-6等表达[34]。因此推测，除抗氧化机制外，槲皮素还可能通过抑制炎症反应修复胎盘炎症，从而改善PM2.5引起的发育毒性。
综上提示，孕期和哺乳期暴露一定剂量的PM2.5可影响子代小鼠生长发育，在本实验所用剂量下，VC和槲皮素干预可在一定程度上改善其不良影响，其机制可能与VC和槲皮素的抗氧化活性有关，但具体机制及适宜剂量还需进一步研究。空气污染的治理尚难在短期内完成，因此，尽快开展个体干预措施研究非常重要，我们的研究成果为PM2.5发育毒性的膳食干预提供了思路。
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