葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phodphate dehydrogenase，G6PD)缺乏症是人类最常见红细胞酶缺陷病之一，全球约有4亿人受累[1]。在我国长江以南地区也较为多见，G6PD基因突变携带率介于4%～10%。G6PD缺乏症为X连锁不完全显性遗传病，主要累及男性个体，男性半合子G6PD酶活性缺乏显著；对于女性纯合子、双重杂合子或单个突变携带者也可发病[2]；女性杂合子酶活性有较大的变异度，其表型从严重缺乏、中度缺乏、轻度缺乏到完全正常均有分布，这种酶活性分布的复杂性导致女性G6PD筛查时检出率低，不管采用目前的荧光斑点试验进行G6PD筛查还是硝基四氮唑蓝法(nitroblue tetrazoliun test, NBT)检测G6PD酶活性，均会出现不同程度的女性G6PD携带者的筛查漏检率。各实验室结果差异巨大，结果从22.7%～58.7%[3]。另外相同的G6PD基因突变对于男性和女性酶活性影响的差异性也缺乏准确结论。由目前的筛查方法入手难以得出真实女性基因携带率，也难以准确研究表型与基因型的关系。为此本文改变从女性筛查到子代的常规思路，由确诊为G6PD缺乏的男性子代开始，逆遗传方向研究母亲G6PD表型与基因型。
对象与方法
一、对象
珠海市妇幼保健院门诊从2015—2017年收集确诊为G6PD酶活性缺乏者男性子代(荧光斑点定性试验和G6PD酶活性定量测定)124例，再收集其母亲标本，男性子代年龄段为1个月～11岁，母亲年龄段为21～42岁。并随机收集40例G6PD荧光斑点试验正常的男性和其母亲血液样本作为对照。本研究通过珠海市妇幼保健院医院伦理委员会批准。
二、方法
1.G6PD酶活性测定：采集所有受试者EDTA-K3抗凝外周血2 ml置于4℃冰箱内24小时内检测，采用荧光斑点试验和硝基四氮唑蓝法分别进行G6PD定性筛查和定量测定。荧光斑点法的血片孵育温度为37℃，底物终浓度为0.78 mmol/L G6PNa2和0.195 mmol/L NADP+，作用时间为10 min[4]，10 min内出现强荧光(灰绿色)为正常，荧光稍弱判断为轻度缺乏，明显减弱判断为中度缺乏，无荧光且20 min后仍无荧光判断为重度缺乏。硝基四氮唑蓝法结果参考值范围：G6PD/6PGD在1.1～2.5之间为正常参考范围，G6PD/6PGD<1.1则为G6PD缺乏。
2.G6PD基因型检测：上述标本均采用厦门致善生物科技有限公司Lab-aid820磁珠法抽提人类白细胞基因组DNA，DNA缓冲液(Tris-EDTA buffer solution)TE溶解，采用紫外分光仪测定其纯度与浓度，以保证所抽提的DNA质量符合要求，在使用时稀释至20 μg/μl。采用荧光PCR熔解曲线法(PMCA)[5]检测常见16种G6PD基因突变，采用配套试剂盒, 严格按照所提供的使用说明书操作。在美国Bio-Rad公司生产的 CFX96 扩增仪上进行扩增和检测。
3.统计学分析：采用SPSS 10.0软件包进行均数
和95%可信区间(confidence interval,CI)等有关数据的处理分析。
结 果
一、男性后代G6PD缺乏者酶活性分布
受检男性后代G6PD荧光斑点法筛查均呈现缺乏，NBT法G6PD酶活性平均值2.66 U/gHb(95% CI:1.1～8.58 U/ gHb)，G6PD/6PGD比值平均值为0.26(95% CI:0.1～0.75)，G6PD酶活性和比值均呈现显著下降，受检者G6PD酶活性分布集中在1～4 U/gHb，大于5 U/gHb仅有5例，所有测定值均小于8 U/gHb(见图1)。
图1 男性子代G6PD缺乏者酶活性分布图
Figure 1 Distribution of enzyme activity in male offspring with G6PD deficiency
二、女性G6PD基因突变携带者酶活性分布
受检母亲G6PD酶活性平均值15.83 U/gHb(95% CI:1.44-31.2 U/gHb)，G6PD/6PGD比值平均值为1.32(95% CI:0.12-2.25)，从分布情况看，除酶活性小于3 U/gHb段(均有双重基因突变)的标本数量多以外，其余以均值为中心，近似于对称分布(见图2)，其范围也涵盖了正常女性G6PD酶活性的全部区间(95% CI:15.86-30.57 U/gHb)。其中被检母亲G6PD酶活性大于13.1 U/gHb(按NBT法判定为酶活性正常)占70.2%(87/124)，而酶活性小于13.1 U/gHb占29.9%，所以按NBT法筛查G6PD基因突变携带母亲漏检率达到70.1%。按荧光斑点试验判断，母亲漏检率更高达74.2%(92/124)。
三、相同的G6PD基因突变对于男性和女性G6PD(排除双重突变)酶活性的影响
由于女性和男性在X染色体数量上的差异，携带相同的基因突变对于男性与女性影响不同，男性G6PD突变半合子酶活性显著下降至正常的11.8%(2.66/22.50)；携带相同突变基因的女性，平均酶活性尚处于正常范围，酶活性轻微下降为正常对照组的80.0%(17.99/22.50)。而携带相同突变基因的男性G6PD酶活性仅相当于其母亲的14.8%(2.66/17.99)，各种不同基因突变类型在男性相对女性G6PD酶活性影响上，1 388(G>A)、1 376(G>T)、95(A>G)、871(G>A)这四种常见突变影响均相近，而1 024(C>T)突变对于男性的影响稍小，各种基因型间的差异不明显。见表1。
图2 女性母亲G6PD缺乏者酶活性分布图
Figure 2 Distribution of enzyme activity in mothers with G6PD deficiency
四、男性子代G6PD突变者与双重突变母亲的表型与基因型比较
男性G6PD缺乏者其母亲也出现严重G6PD缺乏(酶活性小于5 U/gHb)的样本，在所有研究样本中19例双重突变母亲中共有16例母亲G6PD酶活性小于5 U/gHb，平均值为3.28 U/gHb，其男性子代酶活性均小于5 U/gHb，平均值为2.63 U/gHb，19例母亲标本中18例检测出G6PD基因突变双重杂合子或纯合子，另有1例标本中母亲仅检测到95(A>G)突变，但其存在G6PD缺乏表型的子代突变也未检出，推测母亲应该为双重杂合子。还有3例双重杂合突变标本酶活性大于5 U/gHb(95% CI:5.19-6.87 U/gHb)，也接近判断值5 U/gHb，可能与酶测定操作有关或双重杂合子本身存在一定变异。从各种基因突变的组合看，未发现双重杂合子的不同基因型与酶活性有相关性。见表2。
讨 论
G6PD基因突变女性杂合子的酶活性主要由G6PD基因引起，即便是同种突变的女性杂合子也表现出不同的酶活性，从G6PD酶正常到酶显著缺乏均有发生。女性携带单一突变基因，酶活性呈连续性大跨度分布，表型筛查检出率低；男性酶活性仅约为携带相同基因突变的女性的1/6。女性携带双重突变者严重影响G6PD酶活性，与男性半合子相当。因此从男性后代G6PD缺乏者入手，与其母亲进行配对研究，可有效得出女性基因携带率。
逆遗传方向研究女性G6PD表型与基因型，其优势：一是男性子代G6PD缺乏者无论是筛查、酶活性测定和基因诊断，结果明确，反推其母亲必定携带G6PD基因突变；二是男性G6PD缺乏者在人群中的分布是随机的，从而其母亲的选择也是随机的，防止从女性 G6PD缺乏者选择开始导致结论出现偏差；三是可以从男性后代基因型推测母亲基因型或可能的基因型，防止漏检。在G6PD筛查荧光斑点试验与NBT法酶活性测定过程中，在男性中两种结果的吻合度为100%，男性子代G6PD酶活性平均值2.66 U/gHb，G6PD/6PGD比值平均值为0.26，与正常男性对照结果差异明显，不管是G6PD酶活性筛查、酶活性测定和基因检测，均能确诊。需要注意的是男性如果处于急性溶血状态，其G6PD酶活性会应激性增高，可能导致基因型与表型结果不符[6]。男性和女性在G6PD筛查与酶活性测定时诊断效率差异明显，而这种差异性在临床咨询时需注意[7]。
表1 不同基因突变类型对于男性与女性影响程度比较
Table 1 Comparison of the effect of different gene mutation types on male and female
G6PD mutation genotypeCase(n)Average enzyme activityof male offspring Average maternalenzyme activity Theratio of offspringto mothers1 388(G>A)342.6718.540.1441 376(G>T)362.2819.040.12095(A>G)132.3317.380.1341 024(C>T)74.8618.540.262871(G>A)72.2713.260.171Other273.5115.330.229Total1242.6617.990.148
表2 男性子代G6PD突变者与双重突变母亲的表型与基因型比较
Table 2 Comparison of phenotype and genotype between male offspring with G6PD mutation and double mutation mothers
NumberG6PD activity in maleoffspring(U/gHb)G6PD activity inmothers(U/gHb)Ratio of offspringto mothersMaternalgenotypeGenotype ofoffspring11.141.441.261 388/1 3761 388/Y21.631.590.9895/9595/Y 31.721.91.10871/871871/Y 44.601.950.421 388/1 3881 388/Y 53.702.220.61 376/1 0241 376/Y 64.042.250.561 388/1 3761 388/Y 72.202.301.051 388/9595/Y 82.362.361.0095/N∗Unknow/Y 91.782.391.341 388/1 3761 376/Y 102.372.651.121 388/951 388/Y 112.672.771.041 388/1 3761 376/Y 123.703.210.871 376/1 3761 376/Y 133.393.811.131 376/1 3761 376/Y 142.044.102.011 388/1 3881 388/Y 152.774.191.511 388/1 3761 388/Y 162.234.672.091 388/5191 388/Y 172.195.192.51871/1 376871/Y 182.966.542.211 376/5191 376/Y 192.656.872.591 388/1 3761 388/Y Average2.633.281.33
Note：*The G6PD activity in male offspring was decreased but no mutation was detected. It was presumed that the mutation was unknown. The mother only detected 95(A>G) mutation, which was supposed to be a double heterozygous mutation according to the phenotype.
在研究样本中19例双重突变母亲中共有16例母亲G6PD酶活性小于5 U/gHb(属于严重缺乏)，3例双重杂合突变标本酶活性分别为5.19 U/gHb、6.54 U/gHb、6.87 U/gHb(判断为中度缺乏)，总体平均值仅为3.28 U/gHb，而其子代酶活性平均值为2.63 U/gHb，两者G6PD酶活性相当。酶活性测定中儿子低于母亲样本占79.0%(15/19)，说明G6PD基因突变无论如何改变都是对男性的影响甚于女性。另在样本8中其子代具有G6PD缺乏表型，而突变基因类型尚未检出，母亲仅检测到95(A>G)突变，故依据表型推测母亲也为双重杂合子。
对于女性的G6PD表型多样性，多采用Lyon假说的X染色体随机失活进行解释[8]，后来许多学者又对Lyon假说进行过补充，但是在临床上所见的女性的G6PD表型还是具有遗传异质性，携带单一突变基因者酶活性从5.0～31.2 U/gHb，中位数为17.99 U/gHb，与正常女性中位数22.50 U/gHb相比，总体酶活性呈现轻微下降，这可能不仅仅是随机失活的效应，也与女性杂合子G6PD基因启动子区CpG岛特异性甲基化和野生型等位基因优先失活有关，而且野生型等位基因失活与G6PD/6PGD呈负相关，所以G6PD启动子中CpG岛位点具有高特异性甲基化和野生型等位基因优先X染色体失活的杂合子是酶活性缺乏的高危因子[9]。
采用分子诊断方法筛查女性G6PD基因携带者代替大比例漏检风险的表型筛查方法技术上已经成熟[10-12]，对于妊娠或准备孕育的妇女，准确的基因筛查结果有利生育后的及时处理[13]。对于携带相同基因类型的母子，酶活性相差甚多。另外对于女性的表型与基因型复杂关系，在临床咨询中必须予以高度重视。
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